蛋白质的研究方法与原理.ppt

主要步骤： ①建立模板数据库；②构造打分函数；③比对；④预测 3.从头预测法 蛋白质结构从头预测是不依赖模板仅从氨基酸序列信息得到天然结构。它的关键是正确定义能量函数、精确选用计算机搜索算法来寻找能量最低值。 第五节 蛋白质功能分析方法 一、酵母双杂交技术 利用杂交基因通过激活报告基因的表达，探测蛋白质-蛋白质的相互作用。 酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报告基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含Transcription-activating domain的载体。 1）两种蛋白之间是否有相互作用 2）寻找一种蛋白可能的相互作用蛋白 应用 二、噬菌体展示技术 三、表面等离子共振技术 四、蛋白质芯片技术 生 物 芯 片 基因芯片 蛋白质芯片 微流控芯片 蛋白质芯片, 又称蛋白质阵列或蛋白质微阵列，是指以蛋白质分子作为配基,将其有序地固定在固相载体的表面形成微阵列；用标记了荧光的蛋白质或其他它分子与之作用，洗去未结合的成分，经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度，来分析蛋白之间或蛋白与其它分子之间的相互作用关系。 （一）蛋白质芯片的分类 1.根据应用分类:①蛋白检测芯片 将具有高度亲和特异性的探针分子（如单克隆抗体）固定在基片上，用于识别复杂生物样品中的目标蛋白/多肽。根据检测方法,不同蛋白质检测芯片又可进一步分为正相蛋白质检测芯片和反相蛋白质检测芯片。 ②蛋白功能芯片天然蛋白点加在基片上，了解体系中哪种蛋白能与已知的某种蛋白结合，用于天然蛋白活性及分子亲和性研究。 2.根据载体分类： 普通玻璃载体芯片 、微孔型芯片 、多孔凝胶覆盖芯片 3.由Ciphergen Biosystems提出的化学型蛋白质芯片和生物型蛋白质芯片。 蛋白质芯片的应用 临床检验及环境毒物检测所需的免疫检测和酶活性分析 高通量抗体筛选 蛋白质组学 研究生物大分子间的相互作用 蛋白质和小分子间的相互作用 药物靶标及其作用机理的研究 疾病诊断 食品中有毒有害物质的分析、在毒理学及卫生检验中的应用 五、免疫印迹技术 免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（Western blotting），是检测蛋白质混合物中某种特定蛋白质的定性方法，也可以用于确定同一种蛋白质在不同细胞或同一种细胞不同条件下相对含量的半定量方法。免疫印迹也是利用抗原抗体特异反应的原理。 免疫印迹技术（Western blotting)分三个阶段进行。 第一阶段： 十二烷基硫酸钠——聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS) 第二阶段： 电转移，将在凝胶中已经分离的蛋白条带转移到固相载体(PVDF膜）上，选用低电压（100伏）和大电流（1—2A），通电60分钟左右，转移即可完成。 第三阶段： 酶免疫定位：将印有蛋白质条带的PVDF膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带显色。 六、免疫共沉淀技术 原理 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，也可用于确定一种特定蛋白质的新的结合蛋白。 优点：生理条件下的结合 缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用 方法 1) 收获培养的细胞（1×107－1×108）冷PBS洗涤2次 2）细胞裂解液裂解细胞，冰浴30min 3) 12000rpm 离心 30min 4）收集上清并加入适量抗体，4oC摇动1h～过夜 5）加入ProteinA/G-Sepharose(琼脂糖凝胶)悬液， 4oC摇动1h 6）细胞裂解液洗涤ProteinA/G-Sepharose混合液 7）离心弃上清 8）沉淀加2×蛋白Loading Buffer煮沸5－10min 9）离心，上清液跑SDS胶 10）考马氏亮兰染色、银染 Western Blot 质谱分析 注意事项 1）细胞裂解 采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。 不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)，细胞裂解液中要加各种蛋白酶酶抑制剂，如商品化的cocktailer。 2）使用明确的抗体，有的抗体不适宜做免疫共沉淀。 3) 对照实验的设计。 七、GST pull-down技术 原理 细菌表