凡纳对虾Ⅰ型溶菌酶基因的克隆与性质研究.docVIP

凡纳对虾Ⅰ型溶菌酶基因的克隆与性质研究 摘要：以凡纳对虾（Litopenaeus vannamei）I型溶菌酶为研究对象，克隆了I型溶菌酶基因，并进行了氨基酸序列分析、系统进化分析以及分子结构的初步预测，为进一步揭示溶菌酶基因的功能提供理论基础。 关键词：凡纳对虾（Litopenaeus vannamei）；I型溶菌酶；基因克隆 中图分类号：S917.4；Q781 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）22-5541-02 在低等无脊椎动物体内中，溶菌酶是一个重要的免疫反应相关的分子。在清除细菌方面，溶菌酶主要依赖能够水解细菌细胞壁的β-1，4-糖苷键，来清除入侵的细菌和异物，发挥免疫防御作用[1]。本研究以凡纳对虾（Litopenaeus vannamei）中发现的无脊椎动物Ⅰ型溶菌酶为研究对象，克隆了Ⅰ型溶菌酶基因，并进行了氨基酸序列分析、系统进化分析以及分子结构的初步预测，为进一步研究该基因的功能提供理论基础。 1 材料与方法 1.1 材料 凡纳对虾购自于包头市友谊水产市场。 1.2 方法 1.2.1 总RNA的提取与cDNA的合成 参照使用说明书，利用TRizol总RNA提取试剂盒提取凡纳对虾的肝胰腺和鳃等组织的总RNA后，逆转录为cDNA。 1.2.2 目的片段的PCR扩增 根据GenBank中凡纳对虾Ⅰ型溶菌酶基因（Lva-ilys）的cDNA部分序列，设计特异性引物，以cDNA为模板进行PCR反应，扩增cDNA全长序列[2]。 1.2.3 重组T载体的构建与序列测定 目的片段回收、纯化之后，克隆至pMD-18T载体上，转化大肠杆菌DH5α；经过蓝白斑筛选之后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定。 1.3 生物信息学分析 1.3.1 氨基酸序列的比对 将Lva-ilys基因的cDNA序列在NCBI数据库中进行序列比对，选择相似性较高的分子，利用分子生物学软件DNAMAN进行氨基酸序列比对[3]。 1.3.2 系统进化树的绘制 选择物种相近的溶菌酶基因，进行氨基酸序列分析之后，利用分子生物学软件MEGA 4.0进行系统进化树的绘制[4]。 2 结果与分析 2.1 基因克隆和序列分析结果 经过基因克隆、序列测定之后，获得了Lva-ilys的cDNA全长序列，序列大小为556 bp，编码142个氨基酸，其中前17个氨基酸残基形成信号肽结构（图1），从第19个至第131个氨基酸残基形成了溶菌酶的特征结构域——LYZ1结构域。 2.2 氨基酸序列的同源性分析及系统进化树分析 选择与该物种相近的4种其他溶菌酶基因的氨基酸序列，进行氨基酸序列比对分析，结果表明，这些溶菌酶基因的氨基酸序列相似性程度较高，达到了75.5%。系统进化树分析（图2）表明，凡纳对虾Lva-ilys分子与波罗的海海星（Asterias rubens）溶菌酶分子（Aru-Lys）、菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum）溶菌酶分子（Vph-Lys）分布在一个分支上，说明它们之间的亲缘关系更近一些。 2.3 Lva-ilys分子的结构预测 凡纳对虾Lva-ilys分子属于典型的溶菌酶分子，Lva-ilys分子中具有信号肽序列和典型的LYZ1结构域（图3）。结合分子的氨基酸一级结构发现Lva-ilys分子的LYZ1结构域中存在10个半胱氨酸残基，但是不位于保守位置，而且活性位点不明确，只存在一个“CLACMC”基序，这也可能说明Lva-ilys是一个新发现的Ⅰ型溶菌酶分子。 3 小结与讨论 本研究克隆得到的凡纳对虾Ⅰ型溶菌酶，从氨基酸一级结构上来说，具有与其他Ⅰ型溶菌酶分子不同之处。首先，在溶菌酶结构域中，没有发现保守的活性位点，而且存在10个半胱氨酸残基，这是Lva-ilys分子比较特异的地方，也可能说明Lva-ilys分子是一类新的Ⅰ型溶菌酶分子。其次，Lva-ilys分子与其他物种的溶菌酶分子具有较高的同源性，但是在关键作用的半胱氨酸残基中保守性不高，这也可能是影响分子功能的一个重要因素，有待于进一步研究。 参考文献： [1] MAI W J， WANG W N. Protection of blue shrimp （Litopenaeus stylirostris） against the White spot syndrome virus （WSSV） when injected with shrimp lysozyme[J]. Fish Shellfish Immunol，2010，28（4）：727-733. [2] DU Z Q， LI X C， WANG Z H， et al. A single WAP domain （SWD）-containing protein with antipat