实验六大肠杆菌感受态细胞的制备及转化.pptVIP

实验六 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 【目的要求】 1．通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法； 2．掌握大肠杆菌感受态细胞的转化技术； 【实验原理】 细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。细菌处于0 ?C ，CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，外源DNA附着于细胞表面，经42?C短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。将细胞放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新表型如Amp+得到表达，然后将此细菌培养物涂在选择性培养基上进行培养，从而获得转化子。 【实验器材】 高速冷冻离心机，恒温摇床，恒温箱，-20℃冰箱，可调式恒温水浴槽，微量移液器（20μL, 200 μ L， 1000 μ L），超净工作台。 【实验材料】 氨苄青霉素 、大肠杆菌DH5a 、质粒DNA、石蜡膜、EP管，试管、培养皿等。 【试剂】 1. LB培养液 ： 在950mL去离子水中加入，蛋白胨 10g，酵母提取物 (yeast extract)? 5g?，NaCl? 10g，摇动容器直至溶质完全溶解，用Na0H调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1L，121℃湿热灭菌20min。2. 氨苄青霉素(Amp)，用无菌水配制成100mg／mL 溶液，置-20℃冰箱保存。 3 0.05 mol/L的CaCl2 溶液 一、 受体菌的培养 　　从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。 二、 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法) 1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。2、 弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。 3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。4、 感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年。 　 　三、 转化 1、从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液，快速使其解冻，解冻后立即置冰上。2、 加入质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过5μl)，轻轻摇匀，冰上放置20分钟后。 3、42℃水浴中热击90秒，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。 4、向管中加入800μl LB液体培养基 (不含Amp)，混匀后37℃低速振荡培养1小时，使细菌复苏。（表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )）。 5、将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时。 　　同时做两个对照: 　　阳性对照组:以1-2μl DNA溶液转化感受态细胞，其它操作与上面相同。涂板时将菌液涂布于在含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。 　　阴性对照组:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。 阳性对照组:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在不含抗生素的LB平板上，计数菌落的出现数。 　 　四、 计算转化率 　　统计每个培养皿中的菌落数。 　　转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下： 　　转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积 　　转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量(mg) 　　感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积 　　感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数 　　[注意] 本实验方法也适用于其它E.coli受体菌株的不同的质粒DNA的转化。但它们的转化效率并不一定一样。有的转化效率高，需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板,而有的转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离心),才能较准确的计算转化率。 * * 一、感受态的制备及转化