实验六细胞凋亡的形态和生化特征观察.ppt

实验九：细胞凋亡的形态和生化特征观察 实验目的 1.掌握细胞凋亡的形态特征。 2.学会根据染色质的凝聚程度,是否形成凋亡小体和细胞膜通透性变化,鉴别凋亡细胞,坏死细胞及正常细胞。 实验原理 细胞死亡分为2种类型:程序性细胞死亡或称细胞凋亡。凋亡细胞的膜保持完整性,但染色质高度凝聚,有些凝聚块附着于核膜上,使细胞和核的外形发生改变,并产生出大小不同被膜包围的凋亡小体;正常细胞的膜保持完整,且染色质较均匀分布;坏死细胞的膜损伤,染色质凝聚程度远低于凋亡细胞。 仪器、材料和试剂 （一）仪器荧光显微镜,CO2培养箱冰箱,超净工作台,倒置显微镜和离心机等。 （二）材料 体外培养细胞,微量加样器(1 μL-1mL),0。5mL和1。5mL的微量离心管,20 μL。200 μL和1mL吸头,10mL培养瓶,载玻片,盖玻片等。 （三）试剂 HT浓度为1mg/mL的针剂;荧光探针;用PBS(pH7。4)将PI配成500ug/mL的储液,用蒸馏水将Ho。33342配成1mg/mL的储液,2种储液都在-20℃冻存。 实验步骤 1.在超净工作台中进行无菌操作。 实验前约24h,接种3瓶培养细胞,每瓶含6mL培养基。在37℃,5％CO2培养箱中培养。 2.当细胞密度达70-80％时(对数生长期),每瓶约有106个细胞。用无菌离心管离心(1000r/min,5min)收集细胞,弃上清,分别用6mL培养基重悬细胞,用移液管轻轻将细胞悬液移回原培养瓶中,分别进行处理:1号瓶(对照组)加入PBS(pH7。4)6 μL;2号瓶(加药组)加入HT储液6 μL,使HT终浓度为1ug/mL;3号瓶不加任何试剂。 3.加药后放入培养箱培养2.5h。 4.从1号培养瓶中取出178 μL细胞悬液加到1号微量离心管中;从2号培养瓶中取出178 μL细胞悬液加到2号微量离心管中。 5.向2个微量离心管中都加入两种荧光探针:Ho33342储液加2 μL(终浓度为10ug/mL);PI储液加20 μL(终浓度为50ug/mL),混匀,37℃温箱中标记20-30min。 6.将2微量离心管1000r/min,离心5min,余少量上清(约20 μL)悬液细胞(用手指弹微量离心管底)。 7.从微量离心管1(对照组)取10 μL细胞悬液,滴加到载玻片上,盖上盖玻片。从微量离心管2取10 μL细胞悬液,滴加到载玻片上,盖上盖玻片。两组各做2张片子,都作好标记,保存于暗盒中。 8.在荧光显微镜下,先用透射光观察,找到焦面后,再用紫外光激发,40×荧光物镜观察。根据荧光的颜色和细胞的形态进行记录,应看到对照组中的细胞核质均匀,发蓝色荧光;加HT组分3种情况:很多凋亡细胞出现染色质凝聚,边缘化,有凋亡小体,发蓝色荧光;也有些正常细胞与对照组相同,还有少量细胞为坏死细胞,发红色荧光。 9.3个培养瓶中余下的细胞,留做琼脂糖凝胶电泳实验。 注意事项 荧光标记的细胞悬液滴片时,注意载玻片要洁净,悬液量要充满于盖玻片下,但不要产生气泡,多余的要有滤纸条从盖玻片边缘吸去,否则细胞将飘浮运动,不易观察。 两种荧光探针的储液都分装在微量离心管中,-20℃冻存,用前在室温下融化,荧光探针的储存和标记都要保持在暗环境中。紫外光是强激发光,极易漂白荧光。可在荧光观察前,先用透射光找到细胞焦面,再关掉透射光照明,开启紫外光激发样品。 【实验报告】 根据观察,画出几种细胞典型图像。 【思考题】 总结凋亡细胞的形态特征 试述本实验鉴别凋亡细胞,坏死细胞和正常细胞的原理。 二.培养细胞凋亡的生化特征观察 【实验目的】 1.了解凋亡细胞的生化特征 2.学会制作DNA ladder的一种方法 实验原理 由于大多数程序性死亡的细胞中,内源性核酸内切酶活化,核DNA随机在核小体的连接部位被打断,成为寡聚核小体,若对核DNA进行琼脂糖凝胶电泳,可显示以180-200bp为基数的DNA ladder特征;相比之下,正常细胞的DNA不降解,电泳条带表现为一大分子片段;坏死细胞的DNA虽然也存在降解,但由于存在各种长度的DNA片段,无法形成梯状带纹,表现为连续分布的弥散条带。 仪器、材料与试剂 （一）仪器微量加样器,恒温水浴锅,高速离心机,电泳仪和电泳槽,暗箱式紫外透射仪,微量离心管,吸头。 （二）材料 体外培养细胞, （三）试剂 酚,氯仿,TE(pH 8.0),抽提缓冲液,EDTA,蛋白酶K,RNA酶,Tris-Cl,SDS。 实验步骤 一.提取细胞DNA 1.将上面实验留下的3瓶细胞,按原实验分组的顺序,分别作为(1)对照组;(2)加药组;(3)坏死组。 2.将3瓶细胞离心(1500r/min,5min)收集后分别移入3个1.5mL微量离心管中,以下的步骤3个样品同样操作。 3.用机械吹打法制成细胞