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实时定量PCR检测逆境下盐芥ABI1基因表达水平 摘要 运用实时定量PCR的方法对盐芥ABI1基因在干旱、ABA、冷和盐胁迫下的表达情况进行了检测，并对ABI1在耐盐植物中的抗逆能力进行了分析，为粮食作物的耐逆性改良奠定基础。 关键词 实时定量PCR；盐芥；ABI1；胁迫 中图分类号 Q819 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）10-0146-01 植物激素脱落酸（abscisic acid，ABA）在种子萌发、休眠、叶片气孔关闭、植物营养生长过程中具有重要作用[1]。研究表明，ABA在生物体内作为最主要的逆境激素参与了植物对外界胁迫条件的应答[2]。Ser/Thr蛋白磷酸酶PP2C（Ser/Thr phosphatases protein 2C）家族在ABA信号转导中作为负调控因子起重要作用[3]。目前，植物中发现的多种PP2C类磷酸酶均参与ABA的信号传导。其中，家族成员ABI1为ABA信号通路最主要的负调控因子[4]。ABI1可将已磷酸化的ABA信号元件去磷酸化重新合成ABA，从而反馈激活未参加反应的其他ABI1磷酸酶的活性，如此往复完成负反馈循环的调控[5]。在干旱胁迫下，ABI1可通过改变拟南芥ABA的流出量或浓度，从而调控保卫细胞对叶表皮相对湿度和蒸汽压来协助应答[6]。目前，对于拟南芥中ABI1的研究已有较多报道，但是对于ABI1在耐盐植物盐芥中是否具有抗逆性、效果如何还未见报道。 1 材料与方法 1.1 试验材料 野生型盐芥（Thellungiella halophila），种子采自山东省东营盐碱地。 1.2 试验方法 对正常自然环境下生长4周的盐芥野生型植株，分别采取以下处理：200 mmol/L甘露醇模拟干旱处理9 h；60 μmol/L ABA均匀喷施于叶片3、6、12 h；4 ℃冷处理24 h；400 mmol/L NaCl处理24 h；以ThWT作为对照（CK）。处理完毕后迅速提取盐芥叶片总RNA，反转录为cDNA，进行实时定量PCR检测。 根据盐芥ABI1保守区相对特异的区域设计引物如下：ThABI1 F：5′-CTCGCCATGTCAAGATCCATTG-3′；ThABI1 R：5′-TCCGTCATTACATCCCAAACTCCG-3′。所用的内标基因为盐芥Actin2基因，根据NCBI上提供的盐芥Actin2基因序列设计引物如下：ThActin F：5′-ATCTATCCTTGCATCC CTCAGCAC-3′；ThActin R：5′-GGTAACAAACTCACCACCAC GAAC-3′。 反应条件为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s共39个循环；72 ℃ 7 min；溶解曲线从72～95 ℃每隔0.2 ℃读1次板，读板时长1 s。 2 结果与分析 盐芥植株经干旱和盐处理后均出现萎蔫现象，冷处理和ABA喷施叶片的植株无明显表型。该文采用相对定量法（2-ΔΔCT法）对实时定量PCR结果进行了计算和分析，结果如表1所示。可以看出，干旱处理9 h和60 μmol/L ABA处理12 h后，ABI1基因的表达水平分别为WT对照的7.498 836、7.691 864倍，400 mmol/L NaCl处理24 h和4 ℃冷处理24 h后，该基因的表达水平分别为WT对照的3.672 256、2.163 449倍。可以看出ThABI1基因可受干旱、ABA、冷和渗透胁迫诱导表达上调，其中对干旱和ABA有着很强的敏感性。 3 讨论 由实时定量PCR数据可知，ThABI1在多种生物胁迫下具有广泛的抗逆作用。与拟南芥中有所出入，在盐芥中ABI1对与干旱和ABA胁迫上调幅度更为明显，这可能是由于ABI在盐芥干旱和ABA胁迫下，为ABA的直接负反馈作用因子，当受到胁迫时能够迅速作用于ABA信号通路，通过改变叶表皮湿度等方式，调节叶面气孔关闭从而抵抗胁迫。而在冷和盐胁迫中，ThABI1可能为间接作用因子，需要与ThHAB1、ThERD16和ThHB6等其他PP2C家族成员发生级联反应，进行抗逆调控。盐芥是与拟南芥近缘的植物耐逆分子遗传学研究模式系统。对盐芥ThABI1基因的克隆以及对其在各种胁迫环境下基因表达水平有助于进一步深化对植物ABA信号途径的认识，从而更好地理解盐芥耐胁迫机理，为粮食作物的耐逆性改良奠定基础。 4 参考文献 [1] J LEUNG，J GIRAUDAT.Abscisic acid signal transduction[J].Annu Review of Plant Physiol and Plant Mol Biol，1998（49）：199-222. [2] M RAI，N SHEKHAWAT，A GUPTA，et a