本科生实验-水的细菌学检查重点.ppt

水的细菌总数及大肠菌群的测定 授课教师: 孙运军 研 究 生: 穰 杰 王冶红 张印江 陆秀青 概 论 测定水样是否合乎饮用标准，通常包括下列两个 项目： 细菌总数的测定 细菌总数是指1 ml水样在营养琼脂培养基中37℃培养24 h后所生长的菌落数。水中细菌总数可说明水样被有机物污染的程度。标准：1 ml自来水中细菌总数不超过100个。 大肠菌群的测定 大肠菌群是指：一群好氧和兼性厌氧、革兰氏阴性、无芽孢的杆状细菌，并在乳糖培养基中37℃培养24~48 h能产酸产气。水中大肠菌群的数目可以说明水源是否被粪便污染，并间接推测水源受肠道病原菌污染的可能性。标准：1000 ml自来水中大肠菌群数不超过3个。 一 水中细菌总数的测定 目的要求 学习水样细菌总数测定的方法。 了解水源水的平板菌落计数的原则。 基本原理 本实验应用平板菌落计数技术测定水中细菌 总数。目前一般是以在营养琼脂培养基平板上生长 出来的菌落来计算水中细菌总数，因此仅是一种近 似值。 器 材 培养基：营养琼脂培养基，灭菌水 实验用具：灭菌三角烧瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管 操作步骤 1 采集水样 自来水：打开水龙头使水流5 min后，用灭菌三角烧瓶接取水样。 池水：用灭菌三角烧瓶采集水样。 测定细菌总数 自来水： 取三个空的灭菌培养皿，用灭菌吸管在其中两个分别加入1 ml水样，第三个不加。 在以上三个培养皿中分别倾注15 ml已溶化并冷却到45℃左右的营养琼脂培养基，并立即在实验台上作平面旋转，使水样与培养基混匀。 培养基凝固后，倒置于37℃温箱中培养24 h，计算菌落数。 池水 稀释水样：取4个灭菌空试管，分别加入9 ml灭菌水。取1 ml水样注入第一管、摇匀，再从第一管取1 ml至下一管，如此稀释到第四管，则4管稀释度分别为10–1 、10–2 、10–3 与10–4 。 从以上4管中各取1 ml稀释水至空的灭菌培养皿中，每一稀释度做两个培养皿。 向上述8个培养皿各倾注15 ml已溶化并冷却至45℃左右的营养琼脂培养基，立即放在桌上摇匀。 凝固后倒置于37℃温箱中培养24 h。 菌落计数方法 先计算相同稀释度的平均菌落数（整板均匀、半板均匀、片状菌苔超过一半）。 根据各稀释度的平均菌落数按下表计算菌落总数（平均菌落数理想值：30~300）。 二 多管发酵法测定水中大肠菌群 目的要求 学习测定水中大肠菌群数量的多管发酵法。 基本原理 检查水中大肠菌群的方法有多管发酵法与滤膜法。多管 发酵法是将不同体积的水样接种到乳糖胆盐发酵培养基中，然后对各发酵管进行初发酵试验、平板分离和复发酵实验 本次试验初发酵使用煌绿胆盐肉汁培养基 。 初发酵试验 发酵管内装有煌绿乳糖胆盐肉汁培养基（液体），培养基内加有溴甲酚紫作为pH指示剂，并倒有一德氏小管。 平板分离 产酸产气的菌液在伊红美蓝琼脂平板上培养，大肠菌群发酵培养 基中乳糖造成酸性环境时，伊红和美蓝两种染料结合成复合物， 使大肠菌群产生带核心的、有金属光泽的深紫色菌落。 复发酵试验 上述深紫色菌落经涂片染色为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，再进行发 酵试验，24 h后产酸产气者确定为大肠菌群阳性结果。 器 材 培养基：煌绿乳糖胆盐肉汁培养基发酵管（内有倒置德氏小管），伊红美蓝琼脂平板，灭菌水 实验用具：灭菌三角烧瓶，灭菌吸管，灭菌试管 操作步骤 1 采集水样 采用细菌总数测定实验中的池水样品，取其原水样、10–1稀释水样、10–2 稀释水样。 初发酵试验 吸取上述三种水样各1 ml，分别注入装有10 ml普通浓度煌绿乳糖胆盐肉汁发酵管中。另取10 ml原水样注入装有5 ml三倍浓缩煌绿胆盐乳糖肉汁的试管中。混匀后，37℃培养24 h。 3. 平板分离 经24 h培养后，将产酸产气的发酵管分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，于37℃培养24 h，将符合下列特征的菌落的一小部分，进行革兰氏染色，镜检。 深紫黑色、有金属光泽。 紫黑色、不带或略带金属光泽。 淡紫红色、中心颜色较深。 4. 复发酵试验 经镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，则挑取该菌落的另一部分，重新接种于普通浓度的煌绿胆盐乳糖肉汁发酵管中，每管可接种来自同一初发酵管的同类型菌落1~3个，37℃培养24h，结果若产酸又产气，即证实有大肠菌群存在。 证实有大肠菌群存在后，再根据初发酵试验的阳性结果，结合大肠菌群检数表 接种水样总量为11.11 ml，10、1、0.1、0.01 ml各1份，“+”发酵阳性；“-”发酵阴性 得到大肠菌群数。 每组： 2个灭菌三角瓶（300ml，装水样用） 5根2ml移液管 2根10ml移液管 15个平板 5支灭菌空试管（15ml，稀释水样用） 16支空试管