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实验二 聚合酶链反应技术、酶切鉴定 第一节 聚合酶链反应技术 目的： 1．了解PCR基因扩增技术在DNA操作中的重要性及应用范围。 2．熟悉PCR基因扩增的基本原理。 3．掌握PCR基因扩增技术的具体操作过程。 原理： 聚合酶链反应技术（PCR技术）实际上是在模板DNA、引物和四种dNTP存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促反应。在反应中混合下列物质：模板DNA 、四种dNTP 包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP 、引物1、引物2、Taq DNA 聚合酶、缓冲液及Mg2+ MgCl2 ，然后经下列过程大量扩增靶DNA，类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性－退火－延伸三个基本反应步骤构成。 试剂： （1）TaKaRa Taq 5U/ ml （2）10×PCR缓冲液 Mg2+ Plus （3）dNTP混合液 each 10mM （4）DNA模板 10ng （5）引物引物名称 引物序列 5′－3′ 3 的位置 nt 复性温度 产物长度 bp 相互覆盖长度 bp Mit -1F CTC CTC AAA GCA ATA CAC TG 611 58 802 204 Mit -1R TGC TAA ATC CAC CTT CGA CC 1411 Mit -2F CGA TCA ACC TCA CCA CCT CT 1245 58 802 Mit -2R TGG ACA ACC AGC TAT CAC CA 2007 操作步骤： 在一个无菌的0.5mL Eppendorf离心管内加入PCR混合液 μl混匀，用100μl矿物油覆盖于反应混合液之上，以防止反应过程水分蒸发。反应体系各成分名称 反应体系各成分浓度 各成分体积（μl） PCR缓冲液 10 × 2.0 dNTP 200 nmol/L 2.0 MgCl2 25 umol/L 1.5 前向引物 10 umol/L 0.2 反向引物 10 umol/L 0.2 Taq 聚合酶 5 U/ul 0.1 模板DNA 50ng/ul 1.0 ddH2O 18.0 合计 25 2．将Eppendorf离心管放入PCR仪反应仓中。 3．设置PCR反应条件为： 4．PCR产物分析： 采用1.2％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的量、引物扩增的特异性，根据标准DNA的量粗略计算PCR产物的总量，电泳方法见实验一质粒DNA的琼脂糖电泳。 注意事项： 1．用PCR扩增目的基因，一般多采用商品试剂盒。若自己配制试剂，配好后必需高压灭菌。 2．用于PCR扩增的模板DNA一定要纯，以防止反应体系被痕量非目的基因模板污染。 3．吸加PCR试剂时戴上新塑料手套，并在超净工作台上操作，避免操作不当建成污染。 PCR常见问题及分析 1．假阳性 PCR反应十分灵敏，极微量的模板污染就可以造成假阳性的出现，操作人员身体表面、阳性标本、实验室的一切试剂、器材及仪器或者其它与扩增产物接触的物品都是潜在的污染源，从标本的采集、运输、处理过程到PCR的操作应严格遵守操作规程。为了监控PCR实验的污染情况，应该同时设立阴性对照，重复试验，甚至对PCR产物进行测序分析，以鉴定扩增片段的正确性。 2．假阴性 假阴性在PCR反应过程中也较容易出现，常见原因主要有一下几个方面：标本处理不当造成靶DNA的丢失、降解，或者存在抑制PCR反应的杂质；PCR反应体系中Taq DNA 聚合酶失活、Mg2+浓度过低或者没有添加；引物设计不合理、存在二级结构；PCR循环退火温度过高或者PCR仪显示温度与实际运行温度不符；PCR产物在鉴定的过程中没有加入溴化乙啶或电泳时间过长等，在PCR反应中设立阳性对照，一旦发现假阴性结果，从上述几个方面分析原因。 3．引物二聚体 产生引物二聚体的原因有：两条相同的引物或者不同引物分子之间存在较多的碱基配对，特别是引物3′端有互补区域；PCR反应体系中引物与模板比例过高；PCR反应过程中退火温度设定过低或循环次数过多。 4．非特异性PCR扩增 常见的造成非特异性PCR扩增的原因及相应预防措施如下：引物特异性不高或用量过多；Taq DNA聚合酶质量不好或者用量偏高；Mg2+浓度过高；退火温度过低，退火以及延伸时间过长；循环次数过多。除此之外，选择特征性强的序列来进行引物设计，使用纯度较高的引物、酶、Mg2+ 、模板DNA都是有效的方法，必要时还可以使用提高特异性的添加剂。 5、PCR污染及预防措施 潜在的污染源包括待检者、操作人员身体表面，实验室的一切试剂、器材及仪器或其它与扩增产物接触的任何东西都可能成为潜在的污染源。 1）预防措施： ①分开操作区域。在专用超净工作台进行样品制备，专设工作台进行PCR操作，PC