铜、镉及其联合毒性对唐鱼肝脏CYP3A基因表达影响.docVIP

铜、镉及其联合毒性对唐鱼肝脏CYP3A基因表达影响 　　摘要：运用荧光定量PCR方法检测不同暴露时间和暴露浓度的铜、镉单一毒性和其联合毒性对唐鱼（Tanichthys albonubes）肝脏CYP3A基因mRNA表达量的影响。结果表明，铜和镉对唐鱼肝脏CYP3A基因的表达有显著的诱导作用（P0.05）；与单一毒性相比，铜镉联合毒性表现为一定的协同作用。唐鱼CYP3A基因的表达变化对镉、铜胁迫的响应具有一定的可测性和较强的规律性。 　　关键词：唐鱼（Tanichthys albonubes）；CYP3A基因；RT-PCR；联合毒性 　　中图分类号：S949 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）10-2439-04 　　细胞色素P450氧化酶（Cytochmme P450 enzymes，CYP450）主要存在于动物肝脏中，是一类重要的混合功能氧化酶（mixedfunctionoxidase，MFO）[1]，对许多内源性、外源性化合物在体内的生物转化具有重要的作用[2]。CYP3A是鱼类代谢亲脂性有机化合物的主要氧化酶[3]，也是动物肝脏中含量最丰富的CYP450酶，很多药物或环境因子是CYP3A的诱导剂或抑制剂[4]。研究CYP3A在生物体内的变化与污染物浓度的关系对环境污染的监测和预警具有重要意义。 　　唐鱼（Tanichthys albonubes）又名白云金丝鱼，隶属于鲤形目鲤科。由于唐鱼饲养条件要求低、性成熟早、繁殖周期短、产卵量大、病害少、管理条件简单，并且对于许多污染物较敏感，而有望作为一种新的水环境监测生物加以开发研究。然而，关于唐鱼的水生态毒理学研究还仅限于急性毒性及安全浓度评价等方面。本研究运用荧光定量PCR方法检测不同暴露时间和暴露浓度的铜、镉单一毒性及其联合毒性对唐鱼肝脏CYP3A基因表达量的影响，为铜、镉作为淡水鱼类生态毒性的生物分子指示物提供一定参考。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 试验动物 试验唐鱼[体长（2.85±0.17） cm，体重（0.59±0.18） g]由中国水产科学院珠江水产研究所提供，已于实验室培养2代以上，每天投喂热带鱼薄片饲料（德国德彩水族公司生产）两次，水温控制在（25.0±1.0）℃，光暗比为14 h∶10 h，饲养期间鱼活动正常、无病，死亡率低于3%。 　　1.1.2 试剂 Trizol，Premix Taq DNA聚合酶，dNTP Mixture，Ribonuclease Inhibitor，Oligo d（T）15 Primers，Agarose Gel DNA Purification Kit，pMD19-T Vector，SYBR Premix Taq DNA聚合酶，PrimeScript RT-PCR Kit均购自宝生物工程（大连）有限公司；DEPC浓缩液、X-Gal、IPTG和氨苄青霉系购自天根生化科技（北京）有限公司；CuSO4·5H2O，CdCl2·2.5H2O等其余试剂均为国产分析纯。 　　1.1.3 引物 试验所用引物均由宝生物工程（大连）有限公司合成，引物列表如表1。 　　1.2 方法 　　1.2.1 唐鱼总RNA的提取 将唐鱼冲洗干净，在超净工作台上进行解剖，剖取肝脏组织块约50 mg。采用Trizol法提取唐鱼总RNA，用分光光度计测定RNA浓度，并通过1.2%琼脂糖凝胶电泳分析总RNA质量。 　　1.2.2 CYP3A基因的克隆 根据GenBank上的鲫鱼（Carassius auratus）（JN555609）、稀有鮈鲫（Gobiocypris rarus）（EU106659）、锦鲤（Cyprinus carpio）（GU046696）CYP3A基因序列，设计1对简并引物CYP3A-F和CYP3A-R。使用反转录试剂盒PrimeScript RT-PCR Kit进行RNA反转录，得到cDNA，然后进行PCR反应扩增CYP3A基因。PCR反应体系为：cDNA模板2 μL，上下游引物（10 pmol/L）各1 μL，Premix Taq DNA聚合酶25 μL，补ddH2O至50 μL。反应程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，将目的片段用Agarose Gel DNA Purification Kit回收后与pMD19-T载体进行连接，转化至大肠杆菌DH5α，挑选阳性菌落检测目的片段，并送至上海英骏生物技术有限公司测序。 　　1.2.3 唐鱼重金属暴露处理 根据陈辉辉等[5]的急性毒性试验结果，Cu2+对唐鱼96 h的半数致死浓度为0.