DNS-氨基酸的备和鉴定.docVIP

生命科学学院 Life Science College 生 物 化 学 实验报告 姓名：柳伟雄 班级：2013级生科一班 学号：座机电话号码0062 同组者：曾玮璠 山东大学实验报告 2015年3月18日 姓名：柳伟雄 系年级：生科一班2013级 同组者：曾玮璠 科目：微生物实验 题目：DNS-氨基酸的制备和鉴定 仪器编号： 一、目的和要求 1. 了解并掌握DNS-氨基酸的制备和鉴定的原理 2. 掌握制备Dansyl氨基酸和聚酰胺薄膜层析法的操作和方法 二、原理 荧光试剂5-二甲氨基-1-萘磺酰氯 dansyl-Cl，简称DNS-Cl 在碱性条件下与氨基酸 肽或蛋白质 的氨基结合成带有荧光的DNS-氨基酸 DNS-肽或DNS-蛋白质 ，DNS-氨基酸再经酸水解 可释放出DNS-氨基酸 DNS-Cl能与所有的氨基酸生成具荧光的衍生物，其中赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、天冬酰胺等氨基酸可生成双DNS-氨基酸衍生物。这些衍生物相当稳定，可用于蛋白质的氨基酸组成的微量分析，灵敏度可达10－10～10－9mol水平，比茚三酮法高10倍以上，比过去常用的FDNB法高100倍。将Edman法和DNS法结合起来 称为Edman-DNS法 应用于蛋白质结构的序列分析上作，可以提高Edman法的灵敏度及其分析速度。 DNS-氨基酸可用聚酰胺薄膜层析法进行分离和鉴定，在薄膜上检测灵敏度为0.01ug 相当于10—10mol 。由于它具有灵敏度高，分辨力强，快速，操作方便等优点，已被广泛应用于各种化合物的分析。 层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，即各组分所受的固定相的阻力和流动相的推力影响不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。 聚酰胺是—类化学纤维原料，由己二酸与己二胺聚合而成的称锦纶66 。因为在这类物质分子中都含有大量酰胺基团，故统称聚酰胺。它对很多极性物质有吸附作用，这是由于聚酰胺的一C＝O及 NH基能与被分离物质之间形成氢键。如酚类 包括黄酮类、鞣质等 和酸类 如核苷酸、氨基酸等 是以其羟基与酰胺键的羰基形成氢键；硝基化合物和醌类等物质与酰胺键的氨基形成氢键。被分离物质形成氢键能力的强弱，确定吸附能力的差异。在层析过程中，层层溶剂与被分离物质在聚酰胺表面竞相形成氢键。因此选择适当的展层溶剂，使被分离物质在溶剂与聚酰胺表面之间的分配系数能有较大差异，经过吸附与解吸的展层过程，可以一一分离。 山东大学实验报告 2015年3月18日 姓名：柳伟雄 系年级：生科一班2013级 同组者：曾玮璠 科目：微生物实验 题目：DNS-氨基酸的制备和鉴定 仪器编号： 三、试剂和器材 1. 聚酰胺薄膜（7×7cm） 2. 电吹风一个 3. 紫外灯一台 4. 点样管（4支） 5. 吸管 6. 量筒 烧杯（500ml） 8. 铅笔 四、 实验试剂 1. DNS-Cl丙酮溶液 2. 展层液： V 甲酸 ：V 蒸馏水 1.5:100 3. 氨基酸样品：标准Gly、Phe、His溶液 4. 混合氨基酸溶液 四、 测定 1. DNS标记： 取4个小离心管，分别加入氨基酸30ul，再各加入30ulDNS-Cl丙酮溶液，混合均匀后置于37℃水浴中1小时； 2. 点样： 在距聚酰胺薄膜底端0.5-1cm处用铅笔画一条直线，以这条直线为基准，分别取四个离心管中液体用四个不同的点样管在聚酰胺薄膜上点样，直径不宜超过2mm，，重复2-3次，最多不宜超过5次； 3. 展层： 1 配制展层液 V 甲酸 ：V 蒸馏水 1.5:100 100ml，可两个小组共同配制使用； 2 将展层液置于培养皿盖（加12-13ml）或底（加10ml）中，将已点样的聚酰胺薄膜用皮筋套上可使其站立后放入展层液中，盖上500ml烧杯； 山东大学实验报告 2015年3月18日 姓名：柳伟雄 系年级：生科一班2013级 同组者：曾玮璠 科目：微生物实验 题目：DNS-氨基酸的制备和鉴定 仪器编号： 3 待展层液上升到距顶端大约0.5cm时展层结束，将其取出，冷风吹干； 4. 透射： 将冷风吹干的聚酰胺薄膜放在紫外灯下，用铅笔将黄绿色斑点圈出。 五、 实验结果 注：X为色斑中心至原点中心的距离，Y为溶剂前缘至原点中心的距离,其中Y值均相同为 5.20cm。 在混合氨基酸中： 1. 对于赖氨酸：X1 0.45cm ，X2 4.30cm 则Rf1 0.087，Rf2 0.827 2. 对于丙氨酸：X3 2.81cm 则Rf3 0.540 3. 对于苯丙氨酸：X4 1.20cm 则Rf4 0.231 各个标准氨基