合成生物学中的NA合成、组装及应用.docVIP

合成生物学中DNA的合成、组装和应用 摘要 近年来，以微芯片为基础的基因合成技术发生了令人振奋的新发展,基因合成技术具有显著增加产量和降低基因合成成本的潜力，连同更高效的酶促修复技术和基因组装技术，这些新技术正推动合成生物学走向更高水平。 1.基因合成(不确定的地方全部原文标黄) 传统的寡核苷酸合成是用微升体积的溶液在小柱上进行合成。化学物和溶剂过柱后，逐步诱导核苷酸单体添加，形成增长的寡核苷酸链。依据标准的亚磷酰胺化学法，每轮反应包括以下四个步骤：1).脱保护；2).偶联；3). 封闭；4).氧化。过去几十年，商业上主要用固相亚磷酰胺化学法合成DNA。但由于化学反应效率上的局限，合成的寡核苷酸长度大部分不能超过150-200个碱基。如果超过这一长度，每步化学反应的副反应和低效率都会显著影响到序列的完整和产物的产率。 传统上，以DNA聚合酶或连接酶为基础的装配方式的基因构建以柱合成的寡核苷酸为（Traditionally, column-synthesized oligos are used as building blocks for gene construction using either DNA polymerase based or DNA ligase based assembly methods.） 目前对基因装配技术有许多细节上的评价在文献里都能找到。能在一些综述里找到对当前基因装配技术更详细的评估。但是，由于柱基础的寡核苷酸合成花费高、生产量有限，这些都使大规模的基因合成和基因组装配在这个新的合成生物学时代遇到瓶颈。 微阵列芯片作为一个不昂贵的寡核苷酸高密度阵列近年来引起了广泛的关注。 在微阵列芯片上进行合成允许小型化和平行方式产生大量的独特寡核苷酸序列（Synthesis on microarrays allow large numbers of unique oligo sequences to be generated in a miniaturized and parallel fashion），而且在产量、试剂消耗、花费上都有很大优势。与早期的微阵列合成寡核苷酸池进行基因装配相比，后来的微阵列在质量、效率、寡核苷酸合成与基因组装自动化上都有了令人激动的发展。图1总结出了进步之处。 用微阵列技术进行基因合成也有一定的挑战性。最大的挑战就是微阵列产生序列相对质量较差。在平面表面合成的寡核苷酸更容易出错，通常错误率大于柱合成的寡核苷酸。其中一个原因是脱保护剂/脱三苯甲基剂造成的迁延照射（即延长的暴露）使得“脱嘌呤”。通过优化试剂流动和反应条件，安捷伦科技的Leproust小组改进了反应过程，使高保真合成寡核苷酸池提高到200个碱基。另一个（错误率高的）原因是微阵列芯片合成中所谓的“边缘效应”。微阵列芯片合成大体上依靠于硅晶片上的直接且有空间性限制反应的具体机制。比如，安捷伦公司用喷墨印刷技术分配微微升溶剂到芯片上指定的位置。联川生物（LC Sciences）和美国昂飞公司（Affymetrix）在微流体系统中用激发光化学控制解封步骤（deblocking step）。CombiMatrix公司用可编程的微电极阵列在需要的点上进行氧化还原反应。这些例子里，序列的完整性会被没有对准的液滴、光束漂移或不合适的试剂隔离损坏，这就是所谓的“边缘效应”。但我们可以最小化这些“边缘效应”。在一个与喷墨芯片合成平面有关的研究中，一个有硅特性的塑料芯片可以降低“边缘效应”、有效减少合成寡核苷酸池的错误率，大约是200碱基或600碱基错1个（and could effectively reduce the error rate of synthetic oligonucleotide pools from approximately 1 in 200 bases to 1 in 600 bases）, 这个错误率就降到和柱合成差不多的水平了。 除了提高微阵列芯片的质量，近年来新一代测序技术（next-generation sequencing，NGS)作为产生已知序列的芯片造寡核苷酸（sequence-verified chip-made oligos）的预备工具从而进行基因装配（图1b 和图2）。微阵列芯片产生的寡核苷酸送入NGS工具，NGS工具能修正已知的和恢复后的序列（Microarray-derived oligos are fed into a NGS instrument where correct sequences were identified and retrieved）。这种技术预估使序列的精确性提高500倍再生产出来。（照这个趋势）未来的自动化技术可以大