第三章兔血清效价检测(ELISA)课稿.ppt

一、实验目的 了解酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）的原理及优点，学习ELISA的操作过程。 二、原理 抗原－抗体反应的特异性 酶促反应的高效性 三、材料 1.酶标板：以ApxIIA天然毒素（抗原）包被的酶标板（每人一排） 2.洗涤液：1×PBST 3.封闭液：5％脱脂牛奶  4.待检样品：免疫兔血清（一抗） 判断标准：以大于阴性血清OD值2.1倍的最高待检血清稀释倍数，作为血清的效价。 * * 第三章 兔血清效价检测 （ELISA） 二、原理 酶标记抗体（或抗原）与固相载体上的相应抗原（或抗体）结合后，加入底物，酶催化底物出现颜色反应，颜色的深浅与抗原（或抗体）的量相关，用酶标仪测定其吸光值进行定量分析。 二、原理（间接ELISA检测抗体） A：包被抗原；B：加待检血清；C：加酶标二抗；D：加底物、显色；E：终止、读数 A B C D E 二、原理 ELISA技术具有特异、敏感、结果判断客观、简便和安全等优点，在生物学及相关学科中应用广泛。 二、原理 本次实验以APP分泌到细胞外的天然毒素ApxIIA为检测抗原，包被酶标板，通过间接ELISA方法检测兔血清中针对APP毒素的抗体。 三、材料 5.二级抗体：HRP标记的羊抗兔IgG； 6.显色液：TMB显色试剂（ELISA用） 7.终止液：1％SDS 四、操作步骤1.加稀释液 在酶标板第1管加190μl洗涤液，2～11孔加100μl洗涤液，12孔加97.5μl洗涤液。 四、操作步骤2.稀释血清 在第一孔加待检血清10μl，混匀后取100μl到第二孔，依次稀释到第10孔，弃取100μl。 第11孔为空白，不加血清，第12孔加空白血清2.5μl，混匀。 四、操作步骤3.温浴 稀释完成后，做好标记，将酶标板置于37℃反应30min。 四、操作步骤4.洗板 取出96孔酶标板，甩去一抗液，每孔加洗涤液200μl，轻轻振荡1min，拍干，重复洗涤操作3次。 四、操作步骤5.加二抗 在酶标板各孔加入HRP标记羊抗兔IgG（1:5000稀释）100μL，将酶标板置于37℃反应30min。 四、操作步骤 6.洗板 共洗涤5次。 7.加底物 在酶标板各孔加入TMB显色液 100μl，避光室温静置10min。 四、操作步骤 8.加终止液 在各孔加终止液50μL。 9.读数 在630nm波长下以第11孔为空白调零后，读数。 四、操作步骤 10.结果判断