LAPTM4B对人肝癌细胞SMMC―7721的细胞生长的研究.docVIP

LAPTM4B对人肝癌细胞SMMC―7721的细胞生长的研究 摘要：目的：探讨LAPTM4B对人肝癌细胞SMMC-7721的增殖影响及其具体的分子机制。 方法：①通过RT-PCR、WesternBlot实验观察构建的真核表达质粒pcDNA3-LAPTM4B；②MTT实验分析，转染质粒后，SMMC-7721的细胞增殖状态；③流式细胞实验检测转染质粒后，SMMC-7721的细胞周期变化；④WesternBlot实验检测细胞周期蛋白cyclinD1、cyclinE的表达量的变化。 结果： ①成功构建真核表达质粒pcDNA3-LAPTM4B；②转染LAPTM4B后，促进了SMMC-7721细胞的生长；③流式细胞检测发现，转染LAPTM4B后，S期细胞数显著增多，而G0～G1期细胞数减少；④WesternBlot实验发现，转染LAPTM4B后，周期蛋白cyclinD1、cyclinE表达量显著提高。 结论：LAPTM4B通过上调周期蛋白cyclinD1、cyclinE促进肝癌细胞的生长。 关键词：肝癌LAPTM4BcyclinD1cyclinE 【中图分类号】R4【文献标识码】A【文章编号】1671-8801（2012）12-0009-02 原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常见的恶性肿瘤之一，不仅它的发病率居于世界恶性肿瘤的第五位，位于中国恶性肿瘤的第二位[1]。同时它的死亡率也位于世界恶性肿瘤的第四位。但是目前对于HCC的发病机制尚不完全清楚，因此，给临床治疗带来了相当的困难[2]。溶酶体相关四次穿膜蛋白质B（lysosome-associated protein transmembrane 4 beta），缩写为LAPTM4B，它是近几年被发现和研究的肝癌细胞中高表达的基因，目前关于它的功能报道，主要在于细胞增殖与分化方面[3]。本实验主要探讨LAPTM4B对人肝癌细胞SMMC-7721的增殖影响及其具体的分子机制，为临床治疗肝癌提供新的靶点。 1实验材料与方法 1.1实验材料。真核表达质粒pcDNA3来自本实验室，LAPTM4B的cDNA购自SantaCruze，蛋白LAPTM4B、cyclinD1、cyclinE的抗体均购自Abcam，流式细胞术检测试剂盒购自Invitrogen，转染试剂Lipo2000购自Invitrogen，人肝癌细胞SMMC-7721购自中科院细胞库。 1.2细胞的培养与转染。按照ATCC的方法培养细胞。人肝癌细胞SMMC-7721于含10%胎牛血清的DMEM中培养，培养条件为5%CO2，37℃恒温培养箱，2-3天传代一次。 按照Invitrogen的转染试剂Lipo2000的操作说明书，进行细胞的转染。本研究的实验处理为：对照组即不做任何处理的肝癌细胞SMMC-7721组，Mock组即转染空载质粒pcDNA3的细胞组，实验组即转染重组质粒pcDNA3-LAPTM4B的细胞组。 1.3LAPTM4B基因的RT-PCR检测。根据RT-PCR引物设计的数据库，上游：5-CCTATCACTCTGCCCTGAAC-3，下游：5-CCGTACTGTGATTCCTGGTAAGAT-3。根据实验设计的不同分组，分别对细胞进行不同的处理。转染24h后，提取细胞中的RNA，然后逆转录为相应的cDNA序列，根据设计的引物，检测目的基因的mRNA表达水平。同样的细胞处理，然后通过LAPTM4B的蛋白抗体检测目的蛋白的表达。 1.4Western Blot实验检测细胞内LAPTM4B的表达。将对数生长期的肿瘤细胞以5×106/孔的密度分别接种于6孔板中，每孔2ml培液，置于37℃、5%CO2培养箱中进行培养。分别按照实验设计的处理分组，转染细胞24h后，用蛋白裂解液处理细胞，收集蛋白样品。将蛋白样品用BCA蛋白定量试剂盒定量后，每孔加入50μg的蛋白样品进行SDS电泳，电泳结束后，将蛋白转到PVDF膜上。5%的脱脂奶粉封闭1h，加一抗Actin（1∶1000稀释）、LAPTM4B（1∶1000稀释），4℃孵育过夜，TBST洗膜10min×3次后，加荧光二抗（1∶3000）稀释，室温1h，TBST洗膜10min×3，ECL发光检测LAPTM4B的表达。 1.5MTT检测SMMC-7721细胞的体外存活率的影响。将人肝癌细胞SMMC-7721按1×104/孔的密度植入96孔板中，每孔加入100ul细胞培养液培养过夜。实验处理为空白对照组、空载质粒转染组、质粒pcDNA3-LAPTM4B组。72h后，于倒置显微镜下观察细胞的状态，然后在每孔中加入20μl的5mg/ml的MTT溶液，于5%CO2，37℃恒温培养箱继续培养4h，然后小心吸去孔里的培养液，PBS洗一次细胞，每孔加入150μl D