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课题研究的主要内容:
1 利用现代分离分析技术对八宝景天中有效抑菌成分进行分离,分析。
2 对植物各浸膏进行抑菌实验,筛选活性抑菌物质。
3 对提取物有效成分进行结构鉴定。
4 最终筛选出具有较好抑菌活性物质,即抑菌剂。
筛菌
一 抑菌成分的粗提取 取植物干粉50g,然后按照中药熬制方法 分别加水2000ml、1000ml和1000ml,熬3遍,每遍熬制到200~300ml,3遍滤液合并加热浓缩至500ml 制成水剂,经多层纱布过滤后再经细菌滤器过滤除菌,然后放入冰箱冷藏备用。
二 抑菌实验
(1)生长速率法 提取物对病原真菌菌丝生长抑制作用的测定采用生长速率法,设空白为对照。将提取物用无菌水配制成质量浓度为0.5 g.mL-1 ,0.25 g.mL-1 ,0.2 g.mL-1 ,0.15 g.mL -1,0.125 g.mL-1 ,0.1 g.mL-1 , 0.05 g.mL-1 ,0.03 g.mL-1 ,0.02 g.mL-1 ,0.01 g.mL-1 ,9个浓度梯度。
在无菌条件下,将供试菌种用0.4cm 的打孔器打出一定数量的菌饼备用[培养好的病原真菌平板用打孔器打成菌片,放入以平板中央,培养5d后以菌片为中心用打孔器打成菌片 主要为了菌龄一致 ],待培养基溶化后,从高浓度到低浓度用吸管吸取1mL提取物,放入培养皿内,然后趁热倒入9mLPDA培养基于9cm 培养皿中制成薄厚均匀的平板,并设不加提取液的为对照。用灭过菌的镊子小心将菌饼放置在含药培养基上,菌丝一面向下,每皿接1块,每一浓度设3皿,然后加盖并标记,置于23℃恒温光照培养箱中培养,待培养72h后取出培养皿(有些生长较快的病菌培养48h),用菌落计数器量菌落直径 十字交叉量取两次,用其平均数 。按下列公式计算抑制率: 菌落直径 cm 两次直径平均数 - 0.4 菌饼的直径 对照菌落直径-处理菌落直径 抑制率=———————————————— ×100% 对照菌落直径
(2)孢子萌发法 对病菌孢子萌发抑制作用的测定采用载玻片法。均用 PDA培养基按照常规方法培养产孢,每种菌置备3个载玻片,并设清水为对照。将提取物制剂与病菌孢子悬浮液混合,使提取物浓度为0.1 g.mL-1 、0.02 g.mL-1 两个浓度梯度,经适当培养后镜检孢子萌发率,以下列公式计算抑制率: 萌发孢子数 孢子萌发率=——————————×100% 检查总孢子数 对照孢子萌发率-处理孢子萌发率 孢子萌发抑制率=———————————————— ×100% 对照孢子萌发率 实验方案
一 八宝景天提取物化学成分的分离
1 提取过程 称取干燥粉碎的植物若干kg,过60目筛,用95%的乙醇浸泡2h,提取液经真空减压浓缩回收乙醇溶剂得到八宝景天提取浸膏,如此反复3次,最终得乙醇浸膏若干kg。取若干kg浸膏,用少量水分散,然后依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水分别萃取3次,各萃取液经真空减压浓缩,回收溶剂,分别得石油醚提取浸膏,氯仿提取浸膏、乙酸乙酯提取浸膏,正丁醇提取浸膏、水溶液提取浸膏。
2 分离步骤 取石油醚醚浸膏g以160一200目硅胶拌样,自然晾干,研细。采用200~300目硅胶湿法上柱,依次用石油醚、石油醚一乙酸乙酷 1:0一0:Iv/v 、乙酸乙酯、
乙酸乙酯一甲醇 1:O~0:1v/v 进行梯度洗脱,每500ml为一流份,薄层色谱(TLC)跟踪检测,合并相同提取液,再反复经硅胶柱色谱然后配合紫外光谱仪、硫酸显色、等检测方法并通过重结晶纯化手段最终得化合物。 氯仿浸膏、乙酸乙酯浸膏、正丁醇浸膏中化合物的分离同上。
二 抑菌实验
1 抑菌成分的提取分离 同上。以上得到的馏分编号。
2 供试菌株 番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌、黄瓜枯萎病菌、黄瓜炭疽病菌、黄瓜菌核病菌、黄瓜白粉病菌、黄瓜霜霉病菌、辣椒疫霉病菌、油菜菌核病菌、;引起瓜类灰霉病、疫病、白粉病、根腐病、枯萎病、菌核病、蔓枯病、苗期猝倒病、立枯病;引起茄果类蔬菜的灰霉病、菌核病、黄萎病、根腐病、枯萎病、绵腐病、绵疫病、褐纹病、细菌性溃疡病、青枯病、髓部坏死病、苗期猝倒病、立枯病等
3 培养基
(1)马铃薯葡萄糖琼脂培养基 PDA培养基
马铃薯 去皮 200g 葡萄糖 20g 琼脂20g 水1000mL pH值 自然
(2)马铃薯蔗糖琼脂培养基 PSA培养基
马铃薯 去皮 200g 蔗糖 20g 琼脂20g 水1000mL pH值 自然
以上两种培养基具体制作方法是:将200g马铃薯去皮,去芽眼,切成小条放入铝锅中,加入1000mL水,煮沸20~30分钟左右至马铃薯软而不烂时,用6~8层纱布过滤,取滤汁于锅中,补水至1000mL,加入琼脂熔化,再加入糖搅拌均匀,趁热分装于试管中。
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