课题研究的主要内容详细分析.doc

课题研究的主要内容： 1 利用现代分离分析技术对八宝景天中有效抑菌成分进行分离，分析。 2 对植物各浸膏进行抑菌实验，筛选活性抑菌物质。 3 对提取物有效成分进行结构鉴定。 4 最终筛选出具有较好抑菌活性物质，即抑菌剂。 筛菌 一 抑菌成分的粗提取 取植物干粉50g，然后按照中药熬制方法 分别加水2000ml、1000ml和1000ml，熬3遍，每遍熬制到200～300ml，3遍滤液合并加热浓缩至500ml 制成水剂，经多层纱布过滤后再经细菌滤器过滤除菌，然后放入冰箱冷藏备用。 二 抑菌实验 （1）生长速率法 提取物对病原真菌菌丝生长抑制作用的测定采用生长速率法，设空白为对照。将提取物用无菌水配制成质量浓度为0.5 g.mL-1 ，0.25 g.mL-1 ，0.2 g.mL-1 ，0.15 g.mL -1，0.125 g.mL-1 ，0.1 g.mL-1 ， 0.05 g.mL-1 ，0.03 g.mL-1 ，0.02 g.mL-1 ，0.01 g.mL-1 ，9个浓度梯度。 在无菌条件下，将供试菌种用0.4cm 的打孔器打出一定数量的菌饼备用[培养好的病原真菌平板用打孔器打成菌片，放入以平板中央，培养5d后以菌片为中心用打孔器打成菌片 主要为了菌龄一致 ]，待培养基溶化后，从高浓度到低浓度用吸管吸取1mL提取物，放入培养皿内，然后趁热倒入9mLPDA培养基于9cm 培养皿中制成薄厚均匀的平板，并设不加提取液的为对照。用灭过菌的镊子小心将菌饼放置在含药培养基上，菌丝一面向下，每皿接1块，每一浓度设3皿，然后加盖并标记，置于23℃恒温光照培养箱中培养，待培养72h后取出培养皿（有些生长较快的病菌培养48h），用菌落计数器量菌落直径 十字交叉量取两次，用其平均数 。按下列公式计算抑制率： 菌落直径 cm 两次直径平均数 - 0.4 菌饼的直径 对照菌落直径－处理菌落直径 抑制率＝———————————————— ×100% 对照菌落直径 （2）孢子萌发法 对病菌孢子萌发抑制作用的测定采用载玻片法。均用 PDA培养基按照常规方法培养产孢，每种菌置备3个载玻片，并设清水为对照。将提取物制剂与病菌孢子悬浮液混合，使提取物浓度为0.1 g.mL-1 、0.02 g.mL-1 两个浓度梯度，经适当培养后镜检孢子萌发率，以下列公式计算抑制率： 萌发孢子数 孢子萌发率＝——————————×100% 检查总孢子数 对照孢子萌发率-处理孢子萌发率 孢子萌发抑制率＝———————————————— ×100% 对照孢子萌发率 实验方案 一 八宝景天提取物化学成分的分离 1 提取过程 称取干燥粉碎的植物若干kg，过60目筛，用95%的乙醇浸泡2h，提取液经真空减压浓缩回收乙醇溶剂得到八宝景天提取浸膏，如此反复3次，最终得乙醇浸膏若干kg。取若干kg浸膏，用少量水分散，然后依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水分别萃取3次，各萃取液经真空减压浓缩，回收溶剂，分别得石油醚提取浸膏，氯仿提取浸膏、乙酸乙酯提取浸膏，正丁醇提取浸膏、水溶液提取浸膏。 2 分离步骤 取石油醚醚浸膏g以160一200目硅胶拌样，自然晾干，研细。采用200~300目硅胶湿法上柱，依次用石油醚、石油醚一乙酸乙酷 1:0一0:Iv/v 、乙酸乙酯、 乙酸乙酯一甲醇 1:O~0:1v/v 进行梯度洗脱，每500ml为一流份，薄层色谱（TLC）跟踪检测，合并相同提取液，再反复经硅胶柱色谱然后配合紫外光谱仪、硫酸显色、等检测方法并通过重结晶纯化手段最终得化合物。 氯仿浸膏、乙酸乙酯浸膏、正丁醇浸膏中化合物的分离同上。 二 抑菌实验 1 抑菌成分的提取分离 同上。以上得到的馏分编号。 2 供试菌株 番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌、黄瓜枯萎病菌、黄瓜炭疽病菌、黄瓜菌核病菌、黄瓜白粉病菌、黄瓜霜霉病菌、辣椒疫霉病菌、油菜菌核病菌、；引起瓜类灰霉病、疫病、白粉病、根腐病、枯萎病、菌核病、蔓枯病、苗期猝倒病、立枯病；引起茄果类蔬菜的灰霉病、菌核病、黄萎病、根腐病、枯萎病、绵腐病、绵疫病、褐纹病、细菌性溃疡病、青枯病、髓部坏死病、苗期猝倒病、立枯病等 3 培养基 （1）马铃薯葡萄糖琼脂培养基 PDA培养基 马铃薯 去皮 200g 葡萄糖 20g 琼脂20g 水1000mL　 pH值 自然 （2）马铃薯蔗糖琼脂培养基 PSA培养基 马铃薯 去皮 200g 蔗糖 20g 琼脂20g 水1000mL pH值 自然 以上两种培养基具体制作方法是：将200g马铃薯去皮，去芽眼，切成小条放入铝锅中，加入1000mL水，煮沸20～30分钟左右至马铃薯软而不烂时，用6～8层纱布过滤，取滤汁于锅中，补水至1000mL，加入琼脂熔化，再加入糖搅拌均匀，趁热分装于试管中。