甘农4号紫花苜蓿愈伤组织原生质体游离条件的研究.docVIP

甘农4号紫花苜蓿愈伤组织原生质体游离条件的研究 摘要：以甘农4号紫花苜蓿下胚轴诱导所得愈伤组织为材料，研究酶液组合，渗透压调节物甘露醇浓度，酶解时间，愈伤组织继代时间及预处理措施对原生质体游离效果的影响。结果表明：当酶液组合为2%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.3%半纤维素酶，渗透压为0.6 mol/L甘露醇，愈伤组织继代培养时间为12 d，预处理措施为在CPW11溶液中预质壁分离1 h，酶解时间10～12 h时，游离出的原生质体产量最高，可达3.34×106 个/g，原生质体活力高达82.8%。 关键词：甘农4号紫花苜蓿；愈伤组织；原生质体；酶解条件 甘农4号紫花苜蓿（Medicago sativa cv.Gannong No.4）是从6个欧洲苜蓿品种中选择多个优良单株，经母系选择法选育而成。该品种株型紧凑直立，茎枝多，节间长，草层整齐，在初期生长快，可提高建植第1年的草产量，生态适应性广泛，适宜在西部大部分地区栽培。但该品种也存在抗逆性差，病虫害严重，木质素含量高等缺点[1]。 植物原生质体可以由植物原生质体通过酶解大量获得，且具有全能性，可融合性，可转化性，所以是进行作物改良的有效途径之一[2]。在苜蓿中已有许多关于原生质体培养获得再生植株[3-6]、原生质体融合[7，8]以及转基因技术应用[9，10]等方面的报道。但是对甘农4号紫花苜蓿的报道仅限于愈伤组织培养再生植株的报道[11，12]。因此，以甘农4号紫花苜蓿愈伤组织为实验对象，研究酶解因素对其原生质体分离效果的影响，优化酶解条件，为甘农4号紫花苜蓿品种改良奠定基础。 1 材料和方法 1.1 试验材料 甘农4号紫花苜蓿种子由甘肃农业大学草业学院提供。 将成熟饱满的种子先在蒸馏水中浸泡30 min，再用0.1%升汞溶液浸泡10 min，然后，用酒精溶液浸泡1 min，最后在无菌水中洗涤3～5次后接种在1/2MS培养基上，培养条件为25 ℃，2 500 lx，16 h光周期[13，14]。待子叶完全展开而真叶尚未长出时，将下胚轴剪切为3～5 mm节段，于MS+2.0 mg/L 2，4D +1.5 mg/L 6BA+1.5 mg/L NAA培养基中诱导愈伤组织[10，15]，待形成稳定的细胞培养系后，挑选色泽鲜艳，组织结构明显的愈伤组织（图1），用于原生质体游离实验。 1.2 原生质体的分离与纯化 酶解液由不同浓度的纤维素酶，果胶酶，离析酶，崩溃酶及半纤维素酶组成（表1），并溶于CPW11溶液中（配方为27.2 mg/L KH2PO4，101.0 mg/L KNO3，1 480.0 mg/L CaCl2?2H2O，246.0 mg/L MgSO4?7H2O，0.16 mg/L KI，0.025 mg/L CuSO4?5H2O，5.0 mmol/L MES，甘露醇浓度为11%），pH调至5.8～5.9，用0.22 μm的微孔滤膜过滤灭菌后备用。 称取1 g愈伤组织置于盛有10 mL酶液的三角瓶，在25 ℃，50 r/min的摇床黑暗培养。酶解结束后将三角瓶内的液体依次经100目、400目尼龙网筛过滤，滤液收集在15 mL离心管内，800 r/min离心7 min，收集底部沉淀的原生质体，再依次用CPW11溶液和KM8P溶液洗涤2～3次，得到纯化的原生质体[12，16-18]。 1.3 酶解条件的筛选 分别对酶液渗透压、酶解时间、愈伤组织继代时间和预处理措施4个影响原生质体分离的主要酶解条件进行实验。以甘露醇为酶液渗透压的调节物，设0.45、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70 mol/L共6个浓度进行实验；再对酶解持续的时间设6、8、10、12、14、16 h共6个处理进行筛选；之后以继代培养至6、8、10、12、14、16 d的愈伤组织作为酶解材料；设置暗培养（0 lx、24 h），低温培养（4 ℃、24 h）、质壁分离（CPW11溶液中浸泡1 h）及对照（25 ℃、光周期16 h）4个预处理措施进行筛选[12，19-21]。筛选时以不同处理中原生质体产量及活力为衡量依据，得出最佳酶解条件。 1.4 原生质体产量及活力的测定 用血球计数器测定原生质体产量。吸取少量纯化后的原生质体悬浮于血球计数板上，于显微镜下观察统计原生质体个数（中央大方格内25个中方格里的细胞数）。原生质体活力的测定采用荧光染料荧光素双醋酸盐（FDA）活体染色法。FDA用丙酮配制5 mg/mL溶液，吸取25 μL/mL与原生质体悬浮液混合均匀。取1滴染色后的原生质体悬浮液滴在载玻片上，静置5 min后于荧光显微镜下观察其活力[22]。观察时随机选取视野，统计视野中发绿色或黄绿色荧光的细胞数。 1 mL悬浮液中原生质体个数 1个方格悬浮液（0.1 mm3，即0.1 μL）中的细胞数×10×10