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细生实验复习要点 First：3个细胞生物学实验 实验一：光学显微镜的使用方法 使用显微镜时的注意事项 拿显微镜时应右手紧握镜臂，左手托住镜座，不能用一手随便斜提，以防目镜从镜筒滑出和反光镜脱落。 显微镜用完后，必须将目镜、物镜、反光镜等用清洁的擦镜纸或绸布轻轻擦拭，切勿口吹、手摸或用粗布擦拭，勿用乙醇及其他药物擦拭，以免侵蚀镜台或镜头。 使用显微镜应先用低倍镜调节光源，如观察组织细胞或染色较浅标本时，要适当关小光圈，使物像清晰。 放置标本玻片时，应将有盖玻片的一面朝上，用标本夹轻轻夹住玻片的两端，要把要观察的部分对准通光孔的正中央。如果玻片标本放反了，不仅不易找到物象，并且容易压碎玻片，损伤物镜。 观察时要两眼齐睁，用左眼从目镜中寻找物像，仔细观察，用右眼看纸绘图。使用低倍镜用粗调节器调节物距，使用高倍镜必须用细调节器调节物距。粗细调节器都不能做单方向的旋转，如一直上升粗调节器会使镜筒脱落。反之，如一直下降会压碎玻片。 不要随意取出物镜，以防灰尘落入。禁止任意拆卸任何零件，以防意外损失。 显微镜用完后，应转动粗调节器使镜筒徐徐上升，取下玻片，并转动旋转盘，使物镜离开聚光镜，下降镜筒使物镜接近镜台，再装入箱内。 实验二：动物染色体的制备 重点掌握：秋水仙素的作用 抑制纺锤体的形成，从而使有丝分裂停于中期，增加中期分裂相的比例。 选用小鼠骨髓细胞的原因：骨髓细胞数量多，分裂旺盛，不需体外培养和无菌操作，便于取材。 固定液：3:1甲醇-冰醋酸 有固定作用，对染色体还有一定的分散作用。 Giemsa染液 将细胞核染成紫红色 实验三：蟾蜍血细胞的体外融合 重点掌握：PEG（聚乙二醇）的作用过程：PEG是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子量的多聚体，具有强烈的吸水性以及凝聚和沉淀蛋白质的作用。PEG可改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处脂类分子发生疏散和重组，引起细胞融合。 融合的频率和活力与所用PEG的相对分子质量、浓度、作用时间、细胞的生理状态与密度等有关。 试验中终止PEG作用的方法：缓慢向离心管中加入5ml Hanks溶液，轻轻吹打混匀，于37度水浴中静置5min. 异种细胞融合的意义：克服远缘杂交不亲和的障碍，在杂交育种方面有重要意义。 所用染液：詹姆斯绿染液 Second：2个分子生物学实验 实验一：鼠肝基因组DNA的提取与纯化 实验原理：DNA是染色体的主要组成成分，是遗传的物质基础。DNA在生物组织中往往以核蛋白的形式主要存在于细胞核中，分子量甚大。提取DNA最基本的要求是保持DNA大分子的完整性以及纯度，避免机械张力（剪切）引起DNA分子的降解，注意对杂质及蛋白质的去除，防止细胞内存在的DNA酶对DNA的酶解。本实验用蛋白酶K及SDS在EDTA存在的条件下，裂解细胞，消化蛋白质，使核蛋白解聚并使细胞内存在的DNA酶失活，然后用苯酚-氯仿有机溶剂多次抽提后，用透析或乙醇沉淀得到纯化的DNA。 试剂作用： Tris-Cl pH 7.8 :维持pH恒定，防止DNA变性和水解 EDTA（乙二胺四乙酸）：络合二价金属离子，当Mg2+被络合后细胞内释放出的DNA酶的作用被抑制，避免DNA的降解；同时金属离子络合后，细胞膜的稳定性下降，有利于膜的裂解。 SDS（十二烷基磺酸钠）：使蛋白质变性，破坏膜蛋白的构象，使膜裂解，它又能使核蛋白中的核酸与蛋白质解离，并且也具有抑制DNA酶的作用。 苯酚-氯仿混合液（分层，吸取苯酚）：使蛋白质变性 思考题： 1 从生物细胞中提取DNA的主要注意点是什么？应如何控制？ 注意点：尽量保持DNA大分子的完整性及纯度，防止各种物理、化学、生物的影响。 控制：⑴动作要轻柔，使用钝口滴管，以防止外界机械性损伤 ⑵控制适宜的温度和pH，以防止DNA双链氢键断裂，变性 ⑶使用RNase RNA水解酶）、低温、EDTA，防止DNA降解 ⑷样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子 ⑸降低其他生物大分子的污染至最低 ⑹排除其他核酸分子的干扰 2 能引起DNA分子变性的因素有哪些?DNA降解和DNA变性有何区别？如何鉴别？ 因素：加热、极端的pH、有机试剂如甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等 区别：DNA变性是氢键的断裂，是可逆的，对理化性质的影响如增色效应、粘度降低等；DNA降解是破坏磷酸二酯键，不可逆，会使分子量降低。 鉴别：电泳 DNA样品经琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色后，在紫外光激发下，DNA分子会产生橘黄色荧光，根据条带所在位置，可判断DNA分子的大小 实验二：PCR技术检测β-actin基因 原理要掌握（见实验报告P28） 反应中各体系的作用： Tris-HCl :提供稳定的pH 8.3的环境 模板DNA：为复制提供精确的模板 dNTP：提供原料 Tap-DNA聚合酶：提供动力 K