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Bt几丁质酶的研究进展 魏潇 2009221107100070 湖北大学生命科学学院2009级生物工程 0 前言 几丁质酶是催化几丁质水解生成N-乙酰葡糖胺反应的酶。几丁质酶在生物防治方面有两大用途：其一可以防止真菌病害。因为除卵菌外所有真菌的细胞壁都含有几丁质，通过水解细胞壁的几丁质可有效地抑制真菌的生长。其二，对杀虫剂有增效作用。苏云金芽孢杆菌（简称Bt）商品制剂，作为最重要的生物杀虫剂，已成功用于多种农、林、果蔬和卫生害虫的防治，且在减少化学杀虫剂的污染和植物保护中起到了重要作用。许多学者致力于Bt几丁质酶的研究，其目的是为了扩大Bt制剂的作用范围，进一步提高杀虫活性。近几年来，关于几丁质酶在苏云金芽孢杆菌中的分布、酶的产生条件、酶的性质与结构、Bt几丁质酶基因的克隆、几丁质酶在生物防治中的作用等方面的研究逐渐增加。本文对几丁质酶产生生物、酶的性质、酶的种类、酶活的测定方法以及上述内容作一综述，以期为苏云金芽孢杆菌几丁质酶的突变及其酶学性质研究提供参考。 1几丁质酶的来源 能产生几丁质酶的生物很多，包括植物，动物和微生物。几丁质酶最初从兰花球茎中发现，目前在绝大多数高等植物 中都或多或少地发现了这种酶，可存在于根、茎、叶、种子及愈伤组织中，特别是当它们受到真菌感染的时候．1929年Karrer和Hoffman从蜗牛中也分离到几丁质酶，后来又从昆虫体内、人的唾液、猪的器官中发现了这种酶。从微生 物中分离筛选几丁质酶产生菌的报道最近越来越多，海洋中由于积聚有较多的几丁质，因此能利用它的微生物也较多，成为人们筛选的首选目标。Cottrell认为至少 10％的海洋可培养细菌能水解几丁质，Wang等认为有25％～50％的土壤链霉菌能产几丁质酶，真菌产几丁质酶的报道也不少。Cody曾对土壤中几丁质酶产生菌进行过筛选，分离到了39属共 72种细菌和一种假丝酵母 (Candida albicans)。最近Hiramatsu还发现一些病毒如 Chlorellavirus也能产生几丁质酶，这样把几丁质酶产生生物扩展到几乎整个生物界。 2 几丁质酶的特性 由于几丁质酶是一类复合酶，有多种蛋白组成，各种蛋白的性质有其 自身的特点．几丁质酶的分子质量一般在20～120ku之间，其中细菌的几丁质酶多为60～110ku，放线菌的多为 30ku或更低，真菌的一般大于30ku，植物几丁质酶也在 30ku左右，昆虫几丁质酶的分子量较大，一般大于5O ku。大多数细菌性几丁质酶有酸性的等电点，放线菌的一般为中性或碱性，而植物的几丁质酶往往有非常酸性或非常碱性的pI．大多数细菌性几丁质酶的最适 pH为酸性或碱性，而放线菌和真菌的最适pH常是酸性的。关于几丁质酶的热稳定性，一般在6O℃以下稳定，但地衣芽孢杆菌的几丁质酶在IO0℃处理 10min后仍有一半多活性．WangSL发现一种假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa K-187的胞外几丁酶F2有与地衣芽孢杆菌几丁质酶相似的热稳定性。值得注意的是近来 Tanaka从嗜高热古细菌P COCCUSkodakaraensisKOD1中分离到了抗热性很强的几丁质降解酶，ChiA的最适作用温度是85℃，在 100％处理3min后失活，但其缺 失C端的同系物 ChiA△2耐热性很强，在 100℃处理3h后仍保留70％的酶活力，这极大地拓展了几丁质酶的应用范围。 3 几丁质酶的种类 关于几丁质酶这一概念 目前用得 比较混乱，广义的几丁质酶是指所有与几丁质降解有关的酶，还包括脱乙酰酶，壳聚糖酶，几丁寡糖酶，几丁二糖酶等，狭义的几丁质酶是指催化水解至少含有一个N．乙酰葡萄糖胺基团糖苷键的酶，包括几丁内切酶和几丁外切酶。 几丁质酶根据其氨基酸序列特征可分成6类，I、Ⅱ、Ⅳ型归于糖基化水解酶的第 19族 ，主要存在于植物中，Ⅲ、V型归于第 18族 ，广泛存在于病毒、细菌、真菌、昆虫、节肢动物 、植物和哺乳动物中。 绝大多数 的细菌性几丁质酶属于第 18家族 ，其主要功能是分解周围环境中的几丁质，以满足其自身对营养的需求，而对真菌的抑制能力较弱或无；这些酶具有多个功能区域，如催化部位、几丁结合部位、纤维连接蛋 白(fibronectin)Ⅲ区域及钙粘蛋白(cadhefin)区域，但各区域 的功能 尚未被明确阐明。 4 酶活的测定方法 几丁质酶活力一般采用几丁质被水解后形成的还原糖含量的多少来定量．具体测定方法很多，如用 DNS法测还原糖 ，或用 Schales法测释放的氨基糖，或用人工合成的对硝基苯．N．乙酰几丁寡糖作基质来测定释放 的对硝基苯含量，也