N 病毒毒力测实验.docVIP

毒力测试技术路线 前言: 虫媒病毒（Arbovirus）是指由吸血昆虫传播的病毒，其特点是病毒可在昆虫体内繁殖，但昆虫本身不发病，昆虫通过叮咬将病毒传播给人、畜引起疾病，因此虫媒病毒可以引起人畜共患传染病（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）10-8），接种各稀释度的病毒悬液，每个稀释度接种各2孔，每孔0.4mL，摇动12孔板，使布满细胞层。置于37℃吸附1.0 h，每隔15min摇动一次，使病毒充分吸附。吸出孔内液体，加 2%琼脂糖覆盖胶，每孔3.0 （1.5）mL，室温下待覆盖胶凝固，然后细胞面朝上，置37℃孵箱中培养 6-7 d。直接加入4%甲醛固定30min后，自来水冲洗，加入1%的结晶紫或者中性红染液染色10min，自来水冲洗晾干，开始观察计数空斑数，按公式计算空斑形成单位。 空斑形成单位（PFU/mL）＝每孔平均空斑数（PFU）×病毒稀释倍数÷每孔病毒接种量（mL） 1.2.3 NDiV病毒荧光定量 PCR 标准品的制备： 按照RNA提取试剂盒说明书提取NDiV病毒鼠脑悬液的RNA，吸取病毒鼠脑悬液 200μL加入Trizol 500μL，再经过氯仿分离、异丙醇沉淀、冰乙醇洗涤等步骤提取 RNA，20μL DEPC 处理水溶解后反转录为 cDNA，并用上述引物扩增目的基因，片断大小为128 bp，PCR 反应条为：94 ℃ 5 min，94℃ 30 s，58 ℃3 0 s，72℃ 1 min，72℃ 5 min，4℃保存，40个循环。反应结束后用1%琼脂糖凝胶电泳验证扩增产物。而后用胶回收试剂盒对 PCR 产物进行回收，回收产物连接载体，转化DH5α感受态细胞，挑取单个菌落进行 PCR和测序检测，鉴定测序结果与原核酸序列高度同源后，用质粒提取试剂盒提取质粒 DNA，测定质粒浓度，作为标准质粒，按如下公式计算标准质粒拷贝数：质粒拷贝数（copies/μL）=6.02×1023（copies/mol）×质粒浓度（g/μL）/质粒分子量（MWg/mol）（）50）测定（）50测定 领取体重1~2日龄健康乳鼠5窝（40只），按体重随机分为9个剂量组，每组4只，其中第9组为对照组，给予不含病毒的2% FBS DMEM 培养液，其余各组的病毒以10倍递次稀释成 10-1至10-8或100至10-6，每个稀释度分别接种 4 只小鼠，每只脑内注射0.03mL，在有纱窗设备的动物房中饲养。逐日观察乳鼠发病症状，记录各组乳鼠的死亡数与时间。按 Reed 和 Muench 氏法计算 LD50。 LD50的计算： 高于50%的死亡分数-50% 距离比例= ──────────────────── 高于50%的死亡百分数-低于 50%的死亡百分数 LD50的对数=高于50%病毒稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数 1.4 NDiV病毒对鸡致病性实验（）50的测定 将Nidoviruses毒种做 10 倍系列稀释，取 10-1至10-8分别卵黄囊接种6日龄SPF鸡胚各10枚，0.2 mL/枚。37℃孵育（48h 内死亡者弃去，不入记录）至正常出雏日后第3日，统计其未出壳胚数、特异性死亡雏鸡数及有禽脑脊髓炎特异性症状(如头颈震颤或麻痹、运动失调等)的发病雏鸡数，按 Reed-Muench 法计算 EID50。同时设6日龄SPF鸡胚10枚，卵黄囊接种灭菌生理盐水，0.2mL/胚，作对照鸡胚，应至少8枚按时出雏。 1.4.2 NDiV病毒对雏鸡的毒力试验 将毒种稀释至100 EID50，分别通过脑内接种、翅膀刺种和口服的途径接种 1日龄SPF鸡各10只，0.1mL/只，观察28日。每日记录出现AE症状的鸡数（病雏症状有：发育不良，精神不振、易惊，半蹲姿势，重者头颈震颤、运动失调，瘫痪等）。同时设10只SPF鸡对照，分别脑内接种、翅膀刺种和口服的途径接种稀释液0.1mL/只，在同等条件下饲养，观察28日，应不发病。 1.4.3 鸡胚平均死亡时间(MDT)试验 新收获的鸡胚尿囊液用无菌生理盐水10倍倍比稀释后,接种10日龄SPF鸡胚,每个稀释度接种6枚鸡胚,0.2mL/枚,并设生理盐水对照组,35°C孵育7d。定时照胚并记录鸡胚死亡数量和死亡时间,收集尿囊液测定血凝价。使所有鸡胚死亡的最高稀释倍数为病毒的最小致死剂量,MDT是最小致死剂量使鸡胚死亡平均时间,具体计算如下： Xh死亡胚数x Xh+YH死亡胚数x YH MDT = ──────────────────── 死亡总胚数 参考文献: [1] 梁国栋.虫媒病毒研究进展[C].国内外医学科学进展，1999.62- 68. [2] Gorbalenya A E，Enjuanes