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分选效果的影响因素 分选纯度： 液滴的分选模式。（如果要保证分选的纯度则选择purity模式，如果要尽可能分到更多的细胞则选择yield模式，但这会使得率下降） 确保液滴延迟时间准确。（用bead调节Drop delay 98%，保证细胞分选纯度） 选择合适的进样速度，保证效率 75%，70um喷嘴流速一般不超过20000cell/s，100um喷嘴流速一般不超过6000 cell/s。（按具体情况决定，一般最佳分选速度 1/ 3-4 *DDF（DDF-液滴振荡频率） 团块影响和门的设定。（在流式图上清晰地选择目的细胞，上样前用40或70um无菌滤膜进行过滤，去除团块，保证样品为单细胞悬液） 液流稳定性，液流的稳定决定着Drop delay的准确度。（如果不稳定，请用无菌水冲洗，待液流稳定后再分选。70um喷嘴换成100um喷嘴时，因为压力减少，所以需要1h左右稳定液流） 分选得率： 确保液滴延迟时间准确。（不准确的液滴延迟会使大量的非目的细胞被分选，纯度下降的同时导致得率下降） 选纯度（purity）模式会牺牲得率。（如果阳性细胞和阴性细胞粘在一起，纯度模式会将其丢失），如果不需要高纯度，可以选择富集（Yield）模式。 尽量选择70um的喷嘴，同样体积的溶液，比其它大的喷嘴可以得到更多的细胞对细胞的冲击越小 选择合适的进样速度，保证效率 75%。（速度越大，效率越低） 分选活性： 与仪器的无菌清洗有关。要用无菌水长时间冲洗干净。（常规开机时先用酒精冲洗15min，流速为1，然后用无菌水冲洗30-45min，流速为11。关机时先用clean冲洗15min，流速为1，然后用无菌水冲洗30-45min，流速为11） 与压力有关。对于容易破碎的细胞，尽量采用低压和大喷嘴包裹细胞的液滴越大，对细胞的冲击越小） 与喷嘴大小有关。（分选分的是液滴，而不是细胞，大喷嘴形成大液滴，液滴越大，在加电偏转时，液滴所起的主导作用较大，小喷嘴形成小液滴，往往在加电偏转时，细胞所起的主导作用较大，更有可能打在管壁上，造成细胞破碎，且大喷嘴的压力小，对细胞伤害小） 与细胞经过的管壁光滑度有关。（尤其是上样针，需定期由工作人员更换） 与收集管中培养液的液面有关。 调节时保证液滴打在液面上，防止细胞打在管壁上影响活性。建议15ml收集管液面高于3ml，5ml收集管液面高于1ml 与细胞本身的活性有关。 样本的制备方法。（建议在冰上孵育，且放置时间不要过久）