利用多组式聚合酶连锁反应和DNA晶片检测区别胸膜肺炎放线杆菌之.doc

利用多組式聚合酶連鎖反應和DNA晶片檢測區別胸膜肺炎放線桿菌之血清型 Detection of Actinobacillus pleuropneumoniae Serotypes by Multiplex PCR and DNA Microarray 研究生： 沈昱德 ShenYu-De 指導教授：廖明輝 Liao, Mi-Huei 【摘要】 胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae）是豬呼吸道上很重要的一個病原菌，可造成豬隻壞死性、出血性、纖維素性胸膜肺炎，是一種高致死率的豬呼吸道傳染病。此菌有12種血清型，有很多區別此菌血清型的技術，依據莢膜上的專一性抗原是主要用來區別此菌血清型的方法之一，然而，此方法並無法將所有血清型都區分出來，有些可能會交叉反應，而且此方法也很費時。本論文之目的在於找出可快速且有效區分全部血清型的方法，以供未來疾病診斷上的參考。為了增加敏感性與特異性，實驗首先利用核苷酸分析軟體分析及預測莢膜與毒素基因可能具特異性之核苷酸區段，再設計引子並以多組式聚合酶連鎖反應（mutiplex polymerase chain reaction, Multiplex-PCR）增幅出片段基因，再分別分析片段位置而區別血清型。共有四組多組式聚合酶鏈鎖反應，第一組為cpx和HP兩對引子，能區分出菌株來源是否為胸膜肺炎放線桿菌，第二組為SAp5CD、XIBD、AI、SAp2和SGJ五對引子，能區分出胸膜肺炎放線桿菌血清型2、3、4和6，第三組為Ap5AB、SAp1UL、Ap8UL、6-7E和S73五對引子，能區分出胸膜肺炎放線桿菌血清型1、5、7、8和9，第四組為AII和APXIV兩對引子，能區分出胸膜肺炎放線桿菌血清型10、11和12，由此可知本論文之多組式聚合酶連鎖反應能區分此菌的12種血清型。本論文之另一目的在於將多組式聚合酶連鎖反應延伸至DNA晶片的檢測，因此，本論文另將聚合酶鏈鎖反應產物進行定序，利用核苷酸分析軟體分析可能具特異性之核苷酸區段，設計了十一條特異性探針，藉由這些探針檢測區別此菌的12種血清型，每個血清型在晶片上都呈現獨自的點圖譜，而多組式聚合酶鏈鎖反應與DNA晶片檢測的結果也都一致，因此以利於未來對於動物的疾病防治上能有幫助。 關鍵字：胸膜肺炎放線桿菌、多組式聚合酶鏈鎖反應、DNA晶片 【Abstract】 Actinobacillus pleuropneumoniae A. pleuropneumoniae is an important swine respiratory disease pathogen. It can also cause necrosis, hemorrhage, and fibrotic pleuropneumonia in swine and even death in some serious cases. A. pleuropneumoniae has 12 serotypes. There are several techniques for the serotyping of A. pleuropneumoniae. Serotyping of A. pleuropneumoniae is based on detection of the serotype-specific capsular antigen. However, it was not possible to distinguish all serotypes. Which may cross-react with multiple serotyping reagents and are time consuming. The purpose of this study is to find the way to rapid and effective for serotyping. To improve sensitivity and specificity of serotyping. The nucleotide acid sequences with high specificity were predicted and amplified by Multiplex PCR, then according to the PCR product sizes to distinguished the serotypes. There were four teams of the PCR product sizes. The first of cpx and HP primers could distinguish A. pleuropne