生化实验技术理论-电泳技术分解.ppt

电 泳 技 术 电泳的概念 电泳技术分类 电泳技术基本原理 几种常见电泳方法的比较 聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS分离蛋白质 一、电泳的概念 任何一种物质的质点，由于其本身在溶液中的解离或由于其表面对其他带电质点的吸附，会在电场中向一定的电极移动。 带电质点在电场中移动的现象。 二、电泳技术分类 三、电泳技术基本原理 1、基本原理 不同的带电颗粒在同一电场中泳动速度，主要与其所带净电荷量，分子量及分子形状有关。 pH pI 分子带负电荷，在电场中向正极移动; pH pI 分子带正电荷，在电场中向负极移动; 泳动度：带电质点在单位电场强度下的泳动速度。 2.影响电泳速度的因素 (1) 电场强度 泳动速度与电场强度成正比 常压电泳(100-500V)：2-10V/cm，几小时或几天；蛋白质等大分子物质; 高压电泳(500-1000V)：20-200V/cm，几分钟；氨基酸、小肽、核苷酸等小分子物质; （2）溶液的pH值 pH距待分离物质的pI越远，泳动速度越大； （3）溶液离子强度 离子强度越小,电动势越大,泳动速度越快。 （4）电渗现象：在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。 四、几种常见电泳的比较 五、聚丙烯酰胺凝胶电泳 1.原理 具有电泳和分子筛的双重作用 2.聚丙烯酰胺凝胶的聚合 单体：丙稀酰胺（Acr） 交联剂：甲叉双丙稀酰胺交联剂(Bis) 催化剂聚合形成的三维网状结构。 五、聚丙烯酰胺凝胶电泳 2.聚丙烯酰胺凝胶的聚合 催化剂 （1）过硫酸铵-TEMED系统 碱性条件下催化作用 温度与聚合快慢成正比 （2）核黄素-TEMED系统 光激发的催化反应 用量少，对分析样品无影响 聚合时间可自由控制 五、聚丙烯酰胺凝胶电泳 3.聚丙烯酰胺凝胶的孔径 凝胶越浓T?，凝胶孔径↓，所受阻力?，机械强度? 丙稀酰胺浓度 分离物质分子量 4％ 100万 7-7.5％ 1-100万 15-30％ 1万 胶的孔径为蛋白质分子平均大小一半时效果好。 凝胶强度的选择 先用7.5%的标准凝胶或4%--10%的凝胶梯度测试。 五、聚丙烯酰胺凝胶电泳 4.缓冲系统的选择 pH、离子种类和离子强度 酸性蛋白质 高pH 碱性蛋白质 低pH 连续和不连续系统 电泳槽中的缓冲系统和pH 与凝胶相同 电泳槽中的缓冲系统和pH 与凝胶不同，分辨率高 5、聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 （1）聚丙烯酰胺凝胶电泳的四个不连续性 ?.缓冲液成分的不连续性： 凝胶缓冲液Tris-HCl,含Cl－，电极缓冲液Tris-Gly,Gly－ ?.pH的不连续性： 浓缩胶pH6.7,分离胶pH8.9，电极缓冲液pH8.3 ?.电位梯度的不连续性 ?.凝胶层的不连续性 浓缩胶T=6％ ；分离胶T=10％。 5. 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 （2）聚丙烯酰胺凝胶电泳的三种效应 A. 样品的浓缩效应 B. 电荷效应 C. 分子筛效应 A. 样品的浓缩效应 --?缓冲液成分及? pH的不连续性 浓缩胶pH6.7, pIGly为6.0, 缓冲液pH8.3 浓缩胶Tris-HCl, 电极缓冲液Tris-Gly 解离度 ：?Cl- ?蛋 ? Gly 凝胶中Cl－为快离子， Gly－为慢离子，蛋白质样品被夹在中间。 缓冲液成分及pH的不连续性导致蛋白质样品浓缩效应示意图 慢离子 快离子 蛋白质样品 --?电位梯度的不连续性 E：每厘米的电压降 E＝I(电流强度)/?(电导率) E与电泳速度成正比 电泳开始后，由于快离子泳动率最大，在快离子后面形成一个离子浓度低的低电导区，产生较高的电位梯度，使蛋白质样品被进一步浓缩，蛋白质和慢离子加速移动 。 A. 样品的浓缩效应 四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括： --?凝胶层的不连续性： 样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH 8.3) 蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶（ pH 8.9 ），速度变慢，堆积浓缩。 样品在浓缩胶中观察到的浓缩效应 B.样品的电荷效应 C.样品的分子筛效应 分离胶的孔径小，各分子由于大小和形状不同，所受阻力不同，表现出不同的泳动速度，即分子筛作用； 分子量小，形状为球形的泳动速度最快。 * * 安装膜具 装封胶条，注意封胶条平面朝下，不能有裂口 盖上凹玻璃 操作步骤 加 样 插入梳子 电泳 加缓冲液 剥胶 是否用支持物 用支持物电泳 不