噬菌体校价的测定.docVIP

噬菌体校价的测定（预实验用） 供体菌：大肠杆菌E.Coli K12（λ）gal+λ 受体菌：大肠杆菌E.Coli K12 S gal- 噬菌体的诱导和裂解液的制备 （1） 供菌体的活化与培养：取一环供体菌，接种于盛有5 mlLB液体培养基的三角瓶中，37℃培养16 h后，吸5 ml菌液，接种于盛有50mlLB液体培养基的三角瓶中，继续培养4-6 h。 （2） 制备悬浮液：将三角瓶中的菌液倒入离心管，以3500 rpm，离心10 min。离心后，除去上清液，加50 ml磷酸缓冲液，打匀沉淀，再以3500 rpm，离心10 min，这样反复洗三次，制备成悬浮液（25ml）。 （3） 诱导裂解：取悬浮液12.5 ml于15cm培养皿中，经UV处理（15W，距离40 cm），诱导10-20 s。 （4） 避光培养：UV处理后，加入12.5 ml 2倍LB液体培养基，为防止光复活，37℃避光培养2-3 h。 （5） 制备裂解液：吸取培养物于离心管中，再加入0.2 ml氯仿（4-5滴），激烈振荡半分钟，静置5 min，以3500 rpm，离心10 min，吸取上清液，小心把上清液用无菌吸管转移到另一试管，这就是噬菌体 λ gal+的裂解液。 噬菌体效价测定 （1） 受菌体的活化与培养：挑取受体菌一环，接种于盛有5 mlLB液体培养基的离心管中，37℃培养16 h。然后，从受体菌培养液中吸取5 ml，放入盛有45 mlLB液体培养基的三角瓶中，继续培养4-6 h，作指示菌用。 （2） 双层培养测效价：①取已经熔化并于45℃保温的半固体琼脂试管5支，每支加上述的受体菌液0.5 ml。②取噬菌体裂解液0.1 ml，放入盛有0.9 mlLB液体培养基的EP管中，依次稀释到10-7。③从10-3、10-7的试管中分别吸取0.5 ml裂解液，加到有指示菌的半固体琼脂中，摇匀，分别倒入事先准备好的肉汤固体培养基培养皿中，摇匀，凝固后，37℃培养过夜，观察出现噬菌斑数，并计算噬菌体裂解液的效价。 计算方法：效价（单位/毫升） 两皿平均斑数*稀释倍数*取样量折算数。 注：磷酸缓冲液： KH2PO4 1.5g K2HPO4 9g 蒸馏水 1000ml pH7.0