DNA序列技术总结.ppt

C T+C G+A A AACAGTCCTA CCGCTGAAGC A G+A T+C C Maxam－Gilbert化学修饰法优点 所测定的序列直接来自于原DNA分子 不需要体外酶催合成反应 单双链都可以 需要末端标记 两端采用不同的标记，测序可从两端进行 序列分析的自动化 序列自动分析系统，即使用荧光染料标记取代同位素标记，带有荧光标记的DNA分子在激光的激发下便产生了荧光，荧光感受器马上就能感受到荧光信号，并通过信号转换，再输入到数据处理系统，直接将所测得的序列打印出来，便完成了DNA序列的测定。 双脱氧末端终止法、荧光标记法、激光检测法三者结合 使用安全、快速简便 分析样品数量大、结果准确、重复性好 DNA杂交测序 原理 杂交的检测 杂交测序的应用 检测单碱基的变化 序列比较分析 基因的表达状况 验证其他测序 S S S S S S S S S S S S S S S * 理论上，60年代末就已掌握了充分的知识，有可能提前发展出目前的快速DNA序列分析法。只是当时在某些技术能力上和研究思路上，存在着弱点，阻碍了从理论转变为现实。第一，如何分离寡核苷酸片段；另一方面，在研究思路上都没有摆脱蛋白质序列分析的束缚。1965，Cornall大学以S．W．Holle，为首的科学家小组，首次完成75个核苷酸的酵母丙氨酸tRNA的全序列测定。即利用各种RNA酶把tRNA降解成寡核苷酸，经分离纯化后，再分别测定短片段顺序。事实上，早期发展出来的DNA序列分析法，都是与在RNA序列分析中所用的方法有异曲同工之妙。但这些方法对于DNA的序列测定并不适用。后来在DNA序列测定技术上出现的突破是在创新性的研究思路指导下取得的。 * 1977，，剑桥分子生物学实验室的生物化学家F．Sanger 用一种单链的DNA模板和一种适当的DNA合成引物，有时也称引物合成法，或酶催引物合成法。 基本原理 利用DNA聚合酶的两种酶催反应特性：1、利用单链DNA模板，合成DNA互补链；2、利用2’，3’双脱氧核苷三磷酸作底物，参入到寡核酸链的末端，从而终止DNA链的生长。 在同一反应试管中，同时加入引物和模板、DNA聚合酶1、ddTTP、以及 dTTP、dATP、dGTP、dCTP（有一种带放射性标记，温育，产生不同长度DNA片段混合物。具有同样的5’一末端，并在3’一末端的ddTTP处终止。 混合物经变性胶电泳分离，获得一系列全部以3’一末端ddTTP为终止残基的DNA片段的电泳谱带模式。 使用相应于其它核酸的抑制物，如ddATP、ddGTP和 ddCTP，并分别在不同反应试管中温育，然后连同第一个 ddTTP反应，平行加到同一变性凝胶上作电泳分离。最后再通过放射自显影术，检测单链DNA片段的放射性带。结果就可以从放射性X光底片上，直接读出DNA的核酸顺序。 * 引物合成DNA序列测定的各种方法的共同特点及缺陷 高分子量DNA分子通过核酸内切限制酶的消化作用，降解成一组具一定长度的限制片段，然后再用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶作电泳分离纯化，从胶中抽取DNA片段，供进一步分析。然而，为了将这些降解的DNA片段，按其原来的顺序“拼排”起来，至少还需要用一种（有时往往是数种）其它的核酸内切限制酶，对同种大分子量的DNA作酶切消化，并进行电泳纯化和序列分析。这些供作序列测定的DNA片段绝大多数都仅为数百个核酸。因此需要用物理方法分离大量的DNA片段。费时费钱，因为商品提供的核酸内切限制酶的价格是十分显王朝。为了保证能够获得所有的限制片段，就需要制备足多数量的DNA，而其中有许多步骤都要用不同浓度的凝胶进行电泳再纯化。在这种纯化过程中，会加剧DNA的损伤和丢失。 * 即将不同限制酶消化切割的DNA限制片段，随机地克隆到一种合适的载体分子上。使用这样的克隆程序的本身，就可以保证所有来自同一个重组休克隆的后代，都含有一种同源的插入序列。选用天然的单链 DNA噬菌体，例如 M13作为载体进行克隆，所形成的重组体噬菌体也将含有单链形式的DNA插入序列。因此，这样的重组体噬菌体的DNA分子，便可直接用作引物合成反应中的单链模板。序列测定反应中所必须的另一种基本成分——引物，一般是化学合成的特定的寡核苷酸，或者是从亲本单链噬菌体DNA中分离出来的一种限制片段。其特点是能够特异性地同载体分子上与克隆位点相连的单链DNA区段杂交。由引物引导的载体互补链DNA的合成，是从引物l的3’一端开始向克隆序列方向延伸，因此这样的序列可直接供作可靠的序列测定。此种引物称做“通用引物”（universal primer），它可用来对所有的重组体克隆进行序列分析。当然这种随机的方法，也需要通过顺序的测定将派生的序列拼连起来，恢