反相高效液相色潽法RP技术总结.ppt

反相高效液相色潽法 RP-HPLCreversed phase high performance liquid chomatography 应用范围 RP-HPLC被广泛应用于小分子量物质（如多肽）的分离、纯化以及分析。可作为多肽分离的最后筛选，也可用来进行分析性分离，比如肽谱技术。如果分离后是供化学分析用，三维结构不是问题；但如果供晶体学分析，则避免用RP-HPLC。 注意：1.许多具有生物活性的蛋白质对极端pH十分敏感； 2.有机溶剂或高盐溶液会导致蛋白质去折叠和变性； 3.玻璃或疏水物质的吸附作用会导致蛋白质的机械损失，尤其是在蛋白质浓度低的情况下。 但是许多小分子量蛋白（Mr3000）很少会变性（或变性后能够迅速复性），因此能成功分离而保持活性。 实验原理 高效液相色谱仪： 储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等 储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱（固定相) 内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附- 解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。 高效液相色谱仪 实验步骤 1. 用经脱气的HPLC级水洗去反相柱的有机溶剂，梯度从100%有机溶剂到100%水，流速1 ml/min，持续15 min 以上。 2. 以100%的TFA/乙腈缓冲液平衡柱子至柱压和光吸收值达到恒定。用10~15 min 的线性梯度使之逐渐转到0.1%TFA水溶液，并以0.1%TFA平衡15 min。 3. 进行空白样品的层析检查柱子：流速1 ml/min，0~100%TFA/乙腈缓冲液线性梯度，时间45 min 以上，保持在100%TFA/乙腈缓冲液5 min，然后以15 min 的线性梯度回复到0.1%TFA，保持15 min。 实验步骤 4. 将RP多肽标准物或多肽消化的混合物于5000 g 离心5 min。用HPLC只进样器吸取上清，并加之于注射样品环中。 5. 按步骤3的梯度进行层析。收集层析峰于不同的聚丙烯管中。如果柱子的使用间隔时间超过两天时间的话，需要清洗柱子并贮存于有机溶剂中。 6. 用TFA/胍缓冲液溶解收集到多肽，用旋涡混合器使之溶解。 7. 在5 000 g 离心5 min， 并完成第二次，如用于氨基酸序列分析，应直接将样品加到供测序用的玻璃纤维滤膜；如用于氨基酸成分分析，在合适的容器中干燥小份样品并进行后续的水解。 色谱柱 内直径（对于肽类的粗略经验规则） 微克级---1~2mm柱，毫克级---5mm柱， 10~20毫克级---10mm柱，100毫克级---20mm， 0.5~1克级---50mm柱 柱长 对于微量样品，几厘米的短柱足矣；对于较大样品，用直径2mm的细径柱时，增加柱长可明显改变分辨率，典型柱长为15~30cm。 填充物——硅胶 颗粒越小，对柱的反压越大，将限制流速。对于蛋白质和多肽，一般直径为10μm的球状硅胶颗粒较好。 “孔”允许溶剂和溶质分子通过，对于较大的肽和小蛋白，通常用孔径为30nm的硅胶。 衍生化，加上脂肪族或芳香族功能基团。对于小肽，用高碳载，对于较大蛋白，用适中至低的碳载 BioBasic C4 色谱柱 型号规格：250＊4.6mm;5μm BioBasic色谱柱适用于所有生物分子分离需求中的反相、离子交换和尺寸排除相色谱分析方法。 BioBasic C4 色谱柱适用于分离;分析蛋白质与多肽. 填料参数: 粒度: 5μm 孔径:300 比表面积（m2/g）: 100 碳含量（C%）: 4 封尾: 是 USP Listing: L26 可用的填料: C18, C8, C4, Phenyl and Cyano （CN）, Anion Exchange （AX）, Strong Cation Exchange （SCX） 流动相 以极性最强的水为基础溶剂，加入甲醇、乙腈等急性调节剂，极性调节剂的性质以及与水的混合比例对溶质的保留值和分离选择性有显著影响。被测组分的疏水性越强，需有机溶剂的比例越高。 选择弱酸（常用醋酸）、弱碱（常用氨水）或缓冲盐（常用磷酸盐或醋酸盐）作为抑制剂，调节流动相的pH，抑制组分的离解，增强保留。但pH需在固定相允许的范围内。 最高级别的试剂， 对UV具有良好的通透性 1、在进行样品检测前，至少使用20倍柱体积流动相使色谱柱充分平衡。流动相一定要使用色谱级别的溶剂。如使用水相的缓冲液应当天配制以保持新鲜避免细菌产生。 2、流动相使用前需用微孔