流式细胞仪花粉存活率分析.docVIP

流式細胞儀基因組大小及倍體數分析 材料：植物組織葉片 核DNA 含量標準液：雞紅血球細胞核（chicken erythrocyte nuclei, CEN） 2.5pg/2C 鱒魚紅血球細胞核（trout erythrocyte nuclei, TEN） 5.5pg/2C 鱒魚紅血球細胞核（triploid trout nuclei, TTN） 8.25pg/2C Parted CyStain UV or PI absolute P Kit 冰桶 培養皿 刀片 Falcon tube 分析管 事前準備： 流式細胞儀－ 做好光學校正後，選定發散波長所用偵測器 610BP for PI） 方法： 將欲分析之植物組織葉片取約小姆指1-2 節大，秤重加入含CyStain extraction buffer 研磨液（1ml/0.5g），用平面刮鬍刀片將組織切碎，利用30um 孔俓之尼龍濾網過濾到分析管，置於冰桶上。 加入CyStain absolute staining buffer 染劑，染劑加入後約15- 20 分鐘即可供流測分析。 先分析核DNA含量標準品，確認儀器狀況及設定無誤，再分析樣品。估算標準品及樣品 DNA peak在 PI histogram 圖之平均值。 利用下列公式求得植物基因組大小： 未知核基因組大小 （植物細胞核 peak 之平均/ 標準液細胞核peak 之平均）x 標準液細胞核之核DNA 含量值 若為倍體數分析，則先分析確認是二倍體的樣品做為標準品，再比較未知樣品 peak 平均值與標準品 peak 平均值的差異，則可知其倍體數。例如：二倍體 peak 平均值為 300，若未知樣品的 peak 平均值在 600左右，表示是四倍體；若未知樣品的 peak 平均值在450 左右，表示是三倍體。 另亦可以植物做為基因組大小標準品，用與未知樣品相同的 buffer 及方法萃取細胞核後再分析，更能確認樣品製備及操作過程無誤。 常用植物標準品： 資料來源：Annals of Botany 95: 99~ 110, 2005 實例： 1 基因組大小估算 2 倍體數分析 左方為 CEN peak，右方為 sample peak，由 peak mean 可估算未知樣品基因組大小為 417.3/ 355.1x 2.5 2.94pg Peak A 是二倍體，由 peak B及peak C 的 peak mean可求出其 DNA 含量分別是 A 的 1.94 倍（531.8/ 274.8 1.94）及 2.84倍（781.4/ 274.8 2.84），因此B是四倍體、C是六倍體。