第五讲基因工程的酶学基础.docVIP

第五讲 基因工程的酶学基础 吴 乃 虎 中国科学院遗传与发育生物学研究所 2005年8月 目 录 一、导言 1．基因工程诞生的理论基础 2．基因工程诞生的技术基础 3．基因克隆中涉及的主要的核酸酶 二、核酸内切限制酶与DNA分子体外切割 1．简介与定义 2．寄主控制的限制与修饰现象 限制与修饰 若干概念 限制与修饰现象的解释 限制与修饰现象的分子机理 寄主控制的限制与修饰的生物学作用 3．核酸内切限制酶的类型 I型核酸内切限制酶 II型核酸内切限制酶 4．Ⅱ型核酸内切限制酶的特点 基本特点 识别位点 平末端与粘性末端 限制酶的识别序列与切割频率 同裂酶 同尾酶 识别多核苷酸的限制酶 5．核酸内切限制酶的命名 命名原则 实际使用的名称 6．核酸内切限制酶对DNA的消化作用 (1)核酸内切限制酶同靶DNA序列之间的结合模型 (2)核酸内切限制酶对DNA分子的局部消化 (3)真核基因组DNA的酶切消化 (4)DNA的酶切消化体系 7．影响限制酶活性的生物因子及操作条件 (1)DNA的分子特性 (2)酶切消化反应温度 (3)DNA纯度 (4)影响限制酶活性的操作条件 三、DNA连接酶与DNA分子的体外连接 1．引言 2．DNA连接酶 定义 连接条件 最佳连接温度 影响连接反应的因素 3．粘性末端DNA片段的连接 连接过程 碱性磷酸酶的处理 4．平末端DNA片段的连接 T4 DNA连接酶连接法 同聚物加尾法 衔接物连接法 DNA接头连接法 四、热稳定连接酶 1．寡核苷酸连接测定 基本原理 连接物检测 用途 2．连接酶链式反应 裂口连接酶链式反应 不对称裂口连接酶链式反应  基因工程的酶学基础 一、导言 1．基因工程诞生的理论基础 在上一世纪40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，从而明确了遗传的物质基础问题； 在上一世纪50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理，从而解决了基因的自我复制和遗传传递的问题； 在上一世纪50年代末期和60年代初期，科学工作者相继提出了“中心法则”和操纵子学说，并成功地破译了遗传密码，从而阐明了遗传信息的流向和表达的问题； *.遗传的物质基础、基因的复制与传递、遗传信息的流向与表达三大理论问题均得以解决。 2．基因工程诞生的技术基础 DNA分子的体外切割与连接技术的建立 此有赖于核酸内切限制酶与DNA连接酶的发现与应用 第二，DNA分子核苷酸序列的结构分析技术 Sanger双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert的化学修饰法 第三，基因克隆载体的发展与应用 质粒载体的发展与应用 噬菌体载体的发展与应用 第四，大肠杆菌遗传转化技术的建立 20世纪70年代M. Mandel和A. Higa发现 E.coli细胞经过氯化钙处理后，便能够吸收(噬菌体DNA。 1972年斯坦福大学的S. Cohen等人发现，经氯化钙处理的E.coli细胞同样也能够摄取质粒DNA，从而建立了大肠杆菌的遗传转化体系。 第五，琼脂糖凝胶电泳技术的建立与应用 第六，核酸杂交技术的建立 Southern杂交技术的建立。 *有趣的是，上述这些技术几乎都是同时得到发展的，并且迅速地被运用于基因操作实验。于是在20世纪70年代初期，开展DNA体外重组工作，无论在理论上还是技术上都已经具备了条件。 Some of the enzymes used in recombinant DNA technology Enzymes Function TypeⅡ restriction endonucleases Cleaving DNA at specific base sequences DNA ligase Joining two DNA molecules or fragments DNA polymerase I (E.coli) Filling in gaps in duplexes by stepwise addition of nucleotides to 3( ends Reverse transcriptase Making a DNA copy of an RNA molecule Polynucleotide Kinase Adding a phosphate to the 5(-OH end of a polynucleotide to label it or permit ligation Teminal transferase Adding homopolymer tails to the 3(-OH ends of a linear duplex ExonucleaseⅢ Removing nucleotide re