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实例图解简并引物设计一、序言设计一对合适的引物是PCR 扩增目的基因成功的关键，但许多人往往过度依赖 Primer Premier（以下简称PP）或Oligo 等引物设计软件，有时候引物没设计成，却身陷软件之中无法自拔。其实，不论特异性引物或简并引物，只要掌握了几个关键点，手动也可以设计出一对好引物。如果不是大批量设计引物或设计复杂的引物序列，下面的四个常用工具即可轻松胜任引物设计任务。下文以马铃薯Y 病毒CP 基因简并引物设计为示例，分享一些个人经验，希望对初学者能起个抛砖引玉作用。受专业领域及水平所限，文中有不当之处，敬请各位同仁、同学批评指正。二、相关工具MEGA5-多重序列比对、选取基因区域、序列编辑；DNAMAN8-检测两引物的互补性；Oligo Calc-评估引物的属性；Web Logo 3-直观显示简并碱基。三、基本原则设计一对好的引物，归结起来就是 5′端引物、3′端引物之间以及两者与模板的关系处理得恰到好处：两引物的序列要与模板的序列紧密互补；两引物不能在模板的非目的位点发生错配；两引物之间尽量减少二聚体或发夹结构生成。四、延伸原则引物长度：常用为 18-27bp，最大不可超过 38bp，否则容易导致延伸温度过高，不适合 DNA 聚合酶反应；GC 含量：一般介于 40%-60%之间，且两个引物之间的 GC 含量相差不能过于悬殊；碱基分布：随机分布最佳，但避免连续的