基因工程综合实验开题报告格式.docVIP

《基因工程综合实验》开题报告 项目名称： 基因工程菌中Taq聚合酶的提取及活性鉴定 DNA探针的标记与Southern杂交 学 院： 生命科学学院 专业年级： 12生技2班 成员及学号： 陈光煜 3125413118 　　 任勇杰 3125313131 　　　　　　　　　 吴艺委 3125413128 吴少烽 3125413116 2015 年 4 月 12 日 一、立题意义及国内外的研究现状与存在问题 实验二 TaqDNA聚合酶是一种耐热的依赖DNA的DNA聚合酶，最早于1976年首次从水生栖热菌中分离得到。由于TaqDNA聚合酶具有耐高温的特性，Saiki等于1988年将该酶成功地用于PCR技术。Taq 酶在PCR 反应中所起的作用是利用其3′→5′聚合酶活性以DNA为模板，将dNTP中的脱氧单核苷酸逐个加到3-OH末端；同时利用其5′→3′外切酶活性即能识别和消除错配的引物末端， 与复制过程中校正功能有关， 又可以从5’ 端水解核苷酸， 还能经过几个核苷酸起作用，切除错配的核苷酸。由此在链延伸过程中实现链替换，并将被替换的探针切断，故可进行定性与定量检测。 VentTM DNA多聚酶 ： 是美国New England Biolabs公司从潜水艇排气孔 （Vent） 中分离的超级嗜热菌-能生长于98℃中的Thermococcus litoralis中分离纯化得到的，故名Vent酶。它的一些酶学性质较Taq DNA聚合酶更为优越， 它能耐100℃高温且2h以上仍有活力， 并且具有3’→5’外切酶活性的校正能力， 错误扩增的机率比Taq酶降低一倍。近年， 经过基因改造的Hot Start Taq DNA聚合酶，因其低温时酶没有活性， 94℃-95℃加热后开始反应，从而抑制了低温条件下的非特异性扩增， 大大提高了PCR反应的特异性， 同时Hot Start Taq DNA 聚合酶能为PCR反应提供更高的产量及灵敏度、特异性，已逐渐成为PCR 技术的主流。不过，Taq聚合酶的缺点之一为催化DNA合成时的相对低保真性。它缺乏3→5核酸外切酶的即时校正机制，出错率为1/9000。 实验三 探针标记：目前作为探针的标记物有两大类: 一类是同位素 ,一类是非同位素 PCR标记方法是通过聚合酶链式反应,在Taq酶的作用下, 将DIG-11 -dUTP掺入到新合成的DNA链中,适用于100bp～10kb的DNA探针的标记：PCR标记方法是目前较先进的标记方法, 可用于制备高比活性的 DNA 探针,较其他标记方法而言 , 不但经济、快速 , 而且具有模板用量少(2～ 10ng),纯度不高的模板也可用于标记的优点,需要优化的条件少, 标记探针的灵敏度、产量都较高 ,因此被广泛应用于基因组 Southern印迹, Northern印迹 ,文库筛选 ,斑点 / 狭缝印迹, 原位杂交等。 随机引物标记，即本实验采用的同位素标记方法，是以六聚寡核苷酸为引物, 待标记的DNA为模板 , 在DNA 聚合酶Klenow片段作用下, 将DIG -11- dUTP 掺入到新合成的DNA 链中 , 适用于100bp～2kb的DNA 探针的标记。随机引物标记法对模板纯度要求很高, 而且所需模板量较大, 耗时较长,制备后的探针需纯化后才可用于杂交分析, 否则会造成较高的杂交背景。随机引物法标记的探针不具备上述 PCR标记法的优点。 Southern印迹杂交又称凝胶电泳压印杂交技术，是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。该技术是1975年,Southern印迹杂交（Southern blot）由英国人埃德温?迈勒?萨瑟恩 （Edwin Mellor Southern）创建。具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则特异性地杂交形成双链。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）；二是固定