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资源微生物技术 第三章 微生物技术基本试验 1 第三章 微生物技术基本试验 一、培养基的配制 二、灭菌方法 三、接种方法 四、细菌总数目的显微镜计数方法 五、细菌的生长曲线 六、菌体的红外光谱测定样品制备方法 七、菌体的扫描电镜样品制备方法 八 菌体表面Zeta电位的测试方法 2 一、固体培养基的配制 固体培养基 灭菌后摆斜面 3 放入灭菌锅前的液体培养基 一、固体培养基的配制 4 二、灭菌方法 高压蒸汽灭菌法： 1、用途 — （1）无菌水的制备 — （2）玻璃器皿的灭菌 （滴管、移液管、锥形瓶、烧杯） — （3）培养基的灭菌 2、121.5℃下灭菌 20～30分钟。 5 试管或锥形瓶口的密封方法 不正确的棉塞 试管帽 正确的棉塞 6 棉塞的叠法 棉塞的叠法 7 蒸汽高压灭菌锅 电加热圈 水位线 压力表 安全阀 放气阀 8 灭 菌 器 9 灭 菌 器 10 高压蒸汽灭菌步骤 开始加热时， 打开放气阀； 加热至放气阀冒出蒸汽； 5分钟后，关上放气阀； 开始计时，灭菌30分钟； 关上电源开关，自然冷却； 至压力表指针为零，打开放气阀； 打开锅盖6个密封旋钮。 11 步骤： 1、接种前将无菌操作台、接种环、培养基紫外线灭菌30分钟 （摆好了斜面的试管装固体培养基、表面皿装的固体培养基、锥形瓶装的液体培养基） 三、接种方法 接种环 12 无菌操作台 13 2、点燃酒精灯； 3、将接种环的钨丝在酒精灯火焰上加热变红（灭菌）， 4、用接种环在菌种保存试管中轻轻刮少许细菌， 5、快速将带有细菌的接种环浸入液体培养基中； 或在固体培养基中画“之”字形或“井”字形。见下图 三、接种方法 14 15 四、细菌总数目的显微镜计数方法 特制的载玻片正面图 特制的载玻片侧面图 步骤： 1、 将细菌 悬液用蒸馏 水稀释 A倍； 2、 将配好 的细菌稀释 液滴入在玻 片上； 3、 盖好盖 玻片。 16 四、细菌总数目的显微镜计数方法 N1=(n1+n2+n3+n4)/4 N2 N3 N4 N5 载玻片上刻有的大方 格的尺寸： 边长1.0 mm, 盖上盖 玻片，则其间高度为 0.1 mm。 因此，每个大方格的 体积为0.1 立方毫米。 17 四、细菌总数目的显微镜计数方法 n1 18 四、细菌总数目的显微镜计数方法 n2 19 四、细菌总数目的显微镜计数方法 n3 20 四、细菌总数目的显微镜计数方法 n4 21 四、细菌总数目的显微镜计数方法 计算步骤 1、 n ＝ （n1 + n2 + n3 + n4 ）／4 2、 N1 ＝16＊n 3、 N ＝ （N1 ＋ N2 ＋ N3 ＋ N4 ＋ N5）／5 4、 一个大方格（0.1立方毫米）中细菌的总数 ＝ N＊25 5、 1 mL ＝ 1 立方厘米 ＝ 1000 立方毫米； 细菌液稀释了A倍。 6、 1 mL 溶液中总的细菌数为(个) ＝ 1000＊25＊N＊A／0.1 22 五、细菌的生长曲线 在HZQ-C空气浴震荡器中、在28((、160 r/min的震荡频率下培养细菌； 每隔24 h取出100 mL菌悬浮液，采用转速为16000 r/min TGL－16台式高速离心机离心分离10 min后测细菌的湿重。 然后绘制细菌生长时间（h）与细菌生长量（每100 mL菌液中菌体湿重量）曲线。 23 空气浴震荡器 24 25 草分枝杆菌的生长曲线 26 六、菌体的红外光谱测定样品制备方法 操作步骤： 1、离心分离菌体； 2、用蒸馏水洗涤； 3、在50 oC的恒温烘箱中干燥； 4、取干燥的菌体与光谱纯溴化钾一起在玛瑙研体中研磨； 5、将适量的粉末放入压片机中，进行压片； 6、用红外光谱仪（510P FT－IR型）对样品进行分析测定。 27 红外光谱的基本概念 * 红外光谱是一种吸收光谱。在4000～400 cm－1的红外线照射下，有机物分子选择性地吸收其中某些频率后，用红外光谱仪记录所形成的吸收谱带，就称为红外光谱。 * 红外光谱的横坐标是波数（cm－1）或频率；纵坐标是光线的透过率（T％），或摩尔吸收系数来表示： ε＝1/（CL） * lg（I0/I） C—浓度 L—比色池厚度 I—透过光的强度 I0—入射光的强度 28 为什么不同有机基团会产生不同的红外光谱？ ＊ -OH、-SH、-NH等化学键存在振动。 ＊ 振动形式有：伸缩振动、弯曲振动。