液相色谱知识程序.ppt

高效液相色谱知识 第一节 概述 高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。 1．高效液相色谱法与经典液相色谱法 高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可达 103lm·min-1. 2．高效液相色谱法与气相色谱法 第二节  高效液相色谱仪 高效液相色谱仪的结构，一般可分为4个主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统。此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。其工作过程如下：首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。 2．进样系统 高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5～30cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进样系统是引起往前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。 3 分离系统——色谱柱 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长5～30cm，内径为4～5mm，凝胶色谱柱内径3～12mm，制备往内径较大，可达25mm 以上。一般在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离的性能不受影响。 4．检测系统 （l）紫外检测器 (uv检测器 ) （2）荧光检测器 FLD (3) 示差折光检测器RID 几乎所有物质都有各自不同的折射率，因此示差折光检测器是一种通用型检测器。灵敏度可达10-7g·cm-3。主要缺点是对温度变化敏感，并且不能用于梯度淋洗。 （4）可变波长检测器VWD， 二极管阵列检测器DAD,蒸发光散射检测器ELD (5) 附属系统 它包括脱气、梯度淋洗、恒温、自动进样、馏分收集以及数据处理等装置。其中梯度淋洗装置是高压液相色谱仪中尤为重要的附属装置 . 第三节 高效液相色谱的固定相和流动相 （－）固定相 高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.O×108～1.O×109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，就是键合固定相，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5×108Pa （二）流动相 由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲和力，并参与固定相对组分的竞争。因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是： （1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。 （2）溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。表20-2列出了一些常用溶剂的紫外截止波长。 对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。 第四节 高效液相色谱法的主要类型 （－）液一液分配色谱法（LLPC） 在液-液色谱中,流动相和固定相都是液体,它能适用于各种样品类型的分离和分析，无论是极性的和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型的和非离子型的化合物。 1．分离原理 液液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，都是根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。所不同的是液液色谱的分配是在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次