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第十节 淋巴细胞转化试验技术 (Lymphocyte transformation test technique) 一、基本原理 当机体受到抗原（包括特异性的如结核菌素或非特异性的如植物学凝素，PHA等）的刺激时，T淋巴细胞就可以转化为淋巴母细胞，进一步转化为致敏淋巴细胞。这种转化在一定的程度上代表着机体的细胞免疫功能状态。这种转化也可在体外的T细胞的培养过程中加入适当的刺激原而出现，并表现出形态上的变化。目前常采用PHA诱发的淋巴细胞转化试验作为检查机体细胞免疫的功能状态。具体方法主要有两种：一是形态学检查法，即在加有PHA的培养基中，培养淋巴细胞后涂片、染色、镜检以观察形态学变化，计算淋巴细胞的转化率；另一种是同位素标记物掺入转化法，即当淋巴细胞受分裂原刺激发生转化时，必然伴有DNA的大量合成，此时若将具有放射性的3H-TdR(胸腺嘧啶核苷)加到培养液内，则被DNA的原料摄入转化中的细胞内，测定细胞内放射性物质的相对数量（以脉冲数表示），就能客观地测定淋巴细胞的转化程度。后者方法更为准确，且重复性好。 二、形态学检查法 （一）材料与试剂 1．小牛血清 取新生的小牛，无菌采血，分离血清。于56℃灭活后分装小瓶， 放入低温冰箱保存。 2．双抗 配成每毫升含青霉素1.00×104U，链霉素1.00×104U的混合液。存 放于-20℃。 3．6%NaHCO3水溶液 4．肝素 以灭菌生理盐水配成500U/ml，115℃灭菌30min，4℃保存备用。 5．PHA 以灭菌生理盐水配成1 000μg/ml，经G-5漏斗过滤，分装小瓶，保 存于-20℃备用。 6．姬姆萨染液、瑞氏染液。 7．pH6.4磷酸盐缓冲液： KH2PO4 6.62g Na2HPO4 2.56g H2O 1 000.00ml 8．营养液 采用199营养液或RPMI－1640营养液，配法如下： 199营养液 79.00ml 小牛血清 20.00ml “双抗” 1.00ml 依次加入后，再用高压灭菌的6% NaHCO3液调pH至7.2～7.3，分装小瓶，每 瓶0.2ml。 （二）操作方法 1． 于培养瓶内加0.2ml马血，对照组与试验组各做2瓶，试验组均加PHA 30μg； 2．37℃培养72h，每天轻摇1~2次； 3．取出培养瓶，摇散血块，倒入离心管，3 000r/min离心10min，去上清液； 4．用血球泥制备推片，晾干； 5．以瑞氏染液染2min~3min，加等量缓冲液，混匀继续染3min，蒸馏水冲洗 后再用姬姆萨染液染2min~3min。加等量缓冲染液感作7min~8min，馏水冲洗，晾干； 6．镜检，观察，计数。 （三）结果判定 在油镜下，观察淋巴细胞的形态变化（见表21-1），以头、体、尾三部分计算，至少计数100个或200个淋巴细胞，然后按公式计算出淋巴细胞形态转化率。 成年马的淋巴细胞转化率，根据原兽医大学20例检查，平均为35.58%。 不加PHA的对照组一般不转化或转化率只在1%左右。 表21-1 淋巴细胞转化前后形态学特点 项 目 未转化型 转化型 过渡型 大 小（μm） 核与胞浆比例 核 位 置 核 仁 染 色 体 核周围透明区 胞浆内空泡 胞浆呈碱性 7~10 大 几乎占全部胞浆 少或无 致 密 不明显 不明显 不明显 20~35 小 中央或稍偏 一个或数个 疏松有分裂相 明 显 明 显 明 显 12~16 稍大 偏一侧 有或无 疏松 有 有或无 有 转化淋巴细胞的形态特征：①体积增大，约大于原成熟的淋巴细胞的2~3倍；②细胞核膜清晰,核内染色质疏松呈网状结构，可见1~3个核仁,有的核呈分裂相；③胞浆丰富，有嗜碱性染色，核周围的胞浆有一些淡染的透明带，细胞呈伪足状突起。 （四）注意事项 1．培养液最适pH为7.2~7.4，过酸过碱都会影响细胞的生长而降低转化率。培养液的类型与动物的白细胞有关，如小鼠的淋转试验，用RPMI-1640最好，用199液则不成功。 2．培养时间 以72h~120h转化率最高，超过这个时间，则转化率反而下降。 3．吞噬细胞有时在形态上易与“过渡型”混淆。但巨噬细胞有其固有的特点，核占细胞比较小且偏一边，核染色质浓集，细胞浆呈蓝灰色或红褐色，胞浆内有大小不等的颗粒或吞噬物，且含有大小不等的气泡。 4．涂片要少蘸些细胞，推出尾部来，因淋巴细胞较大，易集中在尾部及边缘。 5．观察淋巴细胞转化，染色不要太浓，以便观察核仁。 6．严格的无菌操作，是淋巴细胞转化试验成功的关键。 三、H-胸腺嘧