荧光原位杂交FISH实验步骤与方法.docxVIP

FISH实验步骤 一、实验仪器： 荧光显微镜: 高速离心机：可达12000r/min 高压灭菌锅：160℃以上杀菌 恒温箱：为杂交提供恒定温度 恒温水浴锅 照相机（与荧光显微镜配套）：荧光捕捉图片 二、试剂的配制： 1、0.2mol/ L (pH7.4)磷酸缓冲溶液(PB) 试剂为NaH2P04·2H20和Na2HP04·12H2O。 -----0．2M的NaH2P04溶液: 31.2g NaH2P04·2H20,加蒸馏水1000mL溶解 -----0．2M的Na2HP04溶液: 71.632g Na2HP04·12H2O 加蒸馏水至1000ml溶解 ----0．2M (pH7.4)磷酸缓冲溶液(PB) : 19ml的NaH2P04溶液和81ml的Na2HP04溶液充分混合 高压灭菌，常温保存。 2、0.03 mol/ L磷酸盐缓冲溶液（(PBS） 试剂为NaCl和磷酸缓冲溶液PB ------0.03MPBS溶液：22.8gNaCl ，150ml磷酸缓冲溶液(PB) ，加蒸馏水至1000ml，混匀 ------0.02 MPBS溶液：取100ml 0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至150ml ------0.01 MPBS溶液：取50ml 0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至150ml 高压灭菌，常温保存。 3、4%多聚甲醛溶液（1000ml）（在通风橱内进行操作） -----将略小于2/3体积的水（660ml）加热到50℃， ------40g多聚甲醛PFA，边搅拌边加入到水中，继续保持60℃ -------1滴2mol/LNaOH溶液，立即澄清，但仍有小颗粒。 -------1/3体积的PBS溶液， -------用Hcl将pH调至7.2，定容， -------用孔径为0.22μm的滤膜过滤， ----4℃保存最多保存两天，或者取少量保存在-20℃。 （加热时温度不宜过高，为60℃-65℃，否则PFA容易降解，配置好后应尽快使用，否则固定效果较差）。 4、1mol/L(pH8.0)Tris-HCl缓冲液的配置 ---121.1g Tris(三羟基氨基甲烷), 加800mL蒸馏水溶解，加入大约42mL的浓HCl ---用1M的HCl或lM的NaOH将pH调至8.0，最后加蒸馏水至1000Ml 高压灭菌，4℃冰箱保存。 5、10%SDS ---10g SDS（十二烷基硫酸钠）于50ml灭菌水中，加水至100ml，分装后室温保存。灭菌，或用滤膜过滤 称取SDS时需戴口罩！ 6、0.5M EDTA（pH8.0）溶液的配置 ---- 186.1g乙二胺四乙酸二钠 加800mL蒸馏水溶解，剧烈搅拌(最好使用磁力搅拌机) -----用NaOH调节溶液的pH至8.0，然后定容至1000mL。 7、杂交缓冲液 配置2ml杂交缓冲液于2ml离心管中，各试剂的加入顺序： 360μL 5M NaCl； 40μL 1MTris—HCl xμL 100％甲酰胺（见下表） yμL 无菌水（见下表） 2μL 10％SDS 0.22μm孔径的滤膜过滤，4℃保存。 表1 配置不同甲酰胺杂交液中甲酰胺和无菌水的体积 甲酰胺浓度（%） 甲酰胺体积x（μL） 无菌水体积y（μL） 0 0 1598 5 100 1498 10 200 1398 15 300 1298 20 400 1198 25 500 1098 30 600 998 35 700 898 40 800 798 45 900 698 50 1000 598 55 1100 498 （甲酰胺有剧毒，操作时需戴手套，在通风处内进行，废液需要回收） 不同甲酰胺杂交液的配制 甲酰胺浓度（%） 5M NaCl溶液（mL） 1M Tris-HCl(mL) 10% SDS(mL) 甲酰胺体积x（mL） 无菌水体积y（mL） 20 72 8 0.4 80 239.6 35 72 8 0.4 140 179.6 40 72 8 0.4 160 159.6 55 72 8 0.4 220 99.6 8、杂交后洗涤液的配置 配制50mL杂交洗涤液于50mL离心管中，各试剂加入的顺序如下： Z μL 5M NaCl 1mL 1MTris-HCl(pH7.6) 无菌水加至50mL 50μL 10％SDS 500μL EDTA 表2 根据杂交缓冲液中甲酰胺浓度而定的探针清洗液液中NaCl体积数 甲酰胺浓度% NaCl体积z（μL） NaCl最终浓度（mM） 0 9000 900 5 6400 640 10 4600 460 15 3280 328 20 2250 225 25 1590 159 30 11