蛋白质工程概念及背景.docVIP

蛋白质工程概念及背景 一、概念 蛋白质工程 protein engmeenng ，是基于已知蛋白质的结构与生物功能之间的关系，运用生物信息学、计算机辅助设计、生物化学和晶体学等理论和方法，通过物理、化学和分子生物学等技术手段对蛋白质结构基因进行修饰或改造，生物表达合成具有特定功能的全新蛋白质的技术。 二、蛋白质结构基础 蛋白质结构包括一级序列和二级、三级和四级结构。蛋白质一级序列是指蛋白质多肽链中氨基酸残基的排列顺序，是由基因遗传密码的排列顺序所决定的。一级序列是蛋白质分子的基本结构，决定蛋白质的三维空间结构和相应的生物功能。 蛋白质的二级、三级和四级结构属于三维空间结构。蛋白质二级结构是指蛋白质分子中局部多肽链主链原子形成的特征拓扑结构，其基本构象单元包括α螺旋、β折叠、β转角、无规则卷曲。氢键是维持蛋白质二级结构的主要次级键。超二级结构是指在多肽链内顺序上相邻的二级结构在空间折叠中相互作用而彼此靠近，形成有规则的二级结构聚集体。目前发现的超二级结构主要有三种基本形式，即α螺旋组合 αα 、β折叠组合 βββ 和α螺旋β折叠组合 βαβ ，其中以βαβ组合最为常见。超二级结构的形成，主要是氨基酸残基侧链基团非成键相互作用的结果。结构域是指蛋白质三级结构中的独立折叠单元，通常是几个超二级结构单元的组合。 蛋白质的三级结构是蛋白质的一条多肽链在各种二级结构的基础上再进一步盘曲折叠而形成的三维空间结构。蛋白质三级结构主要通过氢键、疏水键、盐桥和范德华力等非成键相互作用保持稳定。对于单链蛋白质，三级结构即其特征性立体结构，体现了蛋白质的特性和功能。而对于多链蛋白质，具有三级结构的多肽链作为其亚基，尚不具有生物学活性，只有当其两条或多条多肽链问通过相互组合才能形成具有生物学功能的蛋白质四级结构。疏水键是维持蛋白质三级和四级结构的主要非成键。蛋白质的空间构象是其生物学功能的基础，构象发生改变，其功能活性通常也会随之发生变化。 三、蛋白质折叠 一个具有特定活性的蛋白质不仅有特定的氨基酸序列，还要有由此序列形成的特定三维空间结构。从多肽链的一级氨基酸序列转化为具有特征三维结构的活性蛋白质的过程，称为蛋白质折叠。在生物体内，生物信息的传递过程可以分为两个部分：第一步是通过存储于脱氧核糖核酸序列中的遗传信息的转录和翻译来表达合成获得蛋白质的一级序列，即分子生物学的中心法则；第二步是肽链经过折叠组装形成具有特定生物活性的蛋白三维结构。也就是说，遗传密码决定氨基酸序列，而氨基酸序列决定了蛋白质三维结构，蛋白质的生物功能则取决于其有效折叠的三维结构。 1.蛋白质折叠的热力学基础 实验证明，在给定环境 包括溶剂组分、pH值、离子强度、温度或其他成分的存在 中，天然蛋白质的构象是其相对于所有单键旋转自由度来说整体系统吉布斯自由能极小的结构状态。体外蛋白质复性实验，即变性蛋白质在一定环境条件下能自发折叠恢复到变性前的三维空间构象，从而重现其原有的生物活性，是建立上述原理的主要实验依据。1965年中国科学家用化学方法合成牛胰岛素，具有完全生物活性，证明在适宜条件下氨基酸序列可以自发形成其正确的空间构象并表现出相应活性。 另一方面，如果仅仅依据热力学的原理，蛋白质的折叠过程是一个完全自发的随机过程，那么多肽链在折叠过程中将需要尝试每个可旋转单键中的所有可能构象，直到整个蛋白系统处于接近自由能最小点的优势构象。考虑到蛋白质实际含有的可旋转单键数量，蛋白活性结构形成过程中进行构象搜寻所需要的时间会远远超过其实际折叠所需时间。此外，随着研究的深入，人们发现蛋白质的复性并不是完全可逆的，各种因素都有可能影响多肽链在体外的折叠效率。因此，蛋白质的折叠过程也必然受到动力学因素的调控。 2.蛋白质折叠的动力学基础 自20世纪80年代起，随着分子伴侣等生物大分子的发现，分子生物学研究逐渐证明细胞内多肽链的折叠一般来说都是有其他分子参与辅助的形成过程，而非完全的自组装过程，即辅助性组装学说。此学说认为，蛋白质的折叠是由辅助分子协同，经特定动力学途径形成具有生物功能的三维结构过程，而避免了随机组装中大量潜在的高能垒构象取样。因此，蛋白质折叠过程既是热力学的过程，也是动力学的过程。 有助于多肽链折叠的辅助分子主要是蛋白质，可分为两大类：折叠酶和分子伴侣。折叠酶包括二硫键形成酶、二硫键异构酶、脯氨酰顺反异构酶等。分子伴侣的作用机制目前尚不明确，但研究表明其不仅可以帮助多肽链折叠，还可能参与新生蛋白的转运、定位、亚基组装等多个蛋白质的成熟步骤。 四、蛋白质工程的研究策略及目标 蛋白质工程的基本任务就是确定蛋白质的结构与牛物学功能之间的关系，根据需要设计并表达合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质，优化特性及生物活性。其基本途径是从预期功能出发，设计期望的结构，推测相应氨基酸序列，通过