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DEAE纤维素柱层析纯化酶蛋白实验 本实验目的是以柱层析的方法进一步纯化蔗糖酶蛋白，利用DEAE 纤维素树脂作为离子交换剂进行柱层析分级分离。 实验方法 离子交换层析法 实验方法原理 利用DEAE纤维素树脂作为离子交换剂进行柱层析分级分离。 实验材料 酶蛋白 试剂、试剂盒 DEAE纤维素 NaOH HCL Tris-HCl缓冲液 NaCl 仪器、耗材 层析柱 收集器 磁力搅拌器 搅拌子 烧杯 玻璃砂漏斗 水泵 抽滤瓶 pH试纸 pH计 三通管 止水夹 吸耳球 紫外比色杯 尿糖试纸 点滴板 电导率仪 实验步骤 1. ?离子交换剂的处理 称取1.5 克DEAE 纤维素 DE-23 干粉, 加入0 . 5 mol/ LNaOH 溶液 约50ml , 轻轻搅拌, 浸泡至少0.5 小时 不超过1 小时 , 用玻璃砂漏斗抽滤, 并用去离子水洗至近中性, 抽干后, 放入小烧杯中, 加50 ml 0.5 mol/ L HCl , 搅匀, 浸泡0.5 小时, 用去离子水洗至近中性, 再用0.5 mol/ L NaOH 重复处理一次, 用去离子水洗至近中性后, 抽干备用 因DEAE 纤维素昂贵, 用后务必回收 。实际操作时, 通常纤维素是已浸泡过并回收的, 按“ 碱→酸” 的顺序洗即可, 因为酸洗后较容易用水洗至中性。碱洗时因过滤困难, 可以先浮选除去细颗粒, 抽干后用0.5 mol/ L NaOH-0.5 mol/ L NaCl 溶液处理, 然后水洗至中性。 2. ?装柱与平衡 先将层析柱垂直装好, 在烧杯内用0.02 mol/ L, pH7.3 Tris-HCl 缓冲液洗纤维素几次, 用滴管吸取烧杯底部大颗粒的纤维素装柱, 然后用此缓冲液洗柱至流出液的电导率与缓冲液相同或接近时即可上样。 3. ?上样与洗脱 上样前先准备好梯度洗脱液, 本实验采用20 ml , 0.02 mol/ L,pH7.3 的Tris-HCl 缓冲液和20 ml 含0.2 mol/ L 浓度NaCl 的0.02 mol/ L, pH7.3 的Tris-HCl 缓冲液, 进行线性梯度洗脱。取两个相同直径的50 ml 小烧杯, 一个装20 ml 含NaCl 的高离子强度溶液, 另一个装入20 ml 低离子强度溶液, 放在磁力搅拌器上,在低离子强度溶液的烧杯内放入一个小搅拌子 在细塑料管内放入一小段铁丝, 两端用酒精灯加热封口 , 将此烧杯置于搅拌器旋转磁铁的上方。将玻璃三通插入两个烧杯中, 上端接一段乳胶管, 夹上止水夹, 用吸耳球小心地将溶液吸入三通 轻轻松一下止水夹 , 立即夹紧乳胶管, 使两烧杯溶液形成连通, 注意两个烧杯要放妥善, 切勿使一杯高、一杯低。用5 ml 0.02 mol/ L, pH7.3 的Tris-HCl 缓冲液充分溶解醇级分Ⅱ 注意玻璃搅棒头必须烧圆, 搅拌溶解时不可将离心管划伤 , 若溶液混浊, 则用小试管, 4 000 r/ min 离心除去不溶物。取1 . 5 ml 上清液 即醇级分Ⅱ样品, 留待下一个实验测酶活力及蛋白含量 , 将剩余的3 . 5 ml 上清液小心地加到层析柱上, 不要扰动柱床, 注意要从上样开始使用部分收集器收集, 每管2.5～3.0 ml/ 10 min。上样后用缓冲液洗两次, 然后再用约20 ml 缓冲液洗去柱中未吸附的蛋白质, 至A280 降到0.1 以下, 夹住层析柱出口, 将恒流泵入口的细塑料导管放入不含NaCl 的低离子强度溶液的小烧杯中, 用胶布固定塑料管, 接好层析柱, 打开磁力搅拌器, 放开层析柱出口, 开始梯度洗脱, 连续收集洗脱液, 两个小烧杯中的洗脱液用尽后, 为洗脱充分, 也可将所配制的剩余30 ml 高离子强度洗脱液倒入小烧杯继续洗脱, 控制流速2.5～3.0 ml/ 10 min。 测定每管洗脱液的A280 光吸收值。 4. ?各管洗脱液酶活力的定性测定 在点滴板上每一孔内, 加一滴0.2 mol/ L, pH4.9 的乙酸缓冲液, 一滴0.5 mol/ L 蔗糖和一滴洗脱液, 反应5 min , 在每一孔内同时插入一小条尿糖试纸, 10～ 20 min 后观察试纸颜色的变化。用“ + ” 号的数目, 表示颜色的深浅, 即各管酶活力的大小。合并活性最高的2～3 管, 量出总体积, 并将其分成10 份,分别倒入10 个小试管, 用保鲜膜封口, 冰冻保存, 使用时取出一管, 此即“ 柱级分Ⅲ”。 注意: 从上样开始收集, 可能有两个活性峰, 梯度洗脱开始前的第一个峰是未吸附物, 本实验取用梯度洗脱开始后洗下来的活性峰。 在同一张图上画出所有管的酶活力、NaCl 浓度 可用电导率代替 和光吸收值A280 的曲线和洗脱梯度线。