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EGCG对EAE实验方案 实验材料 实验动物：C57BL/6雌性小鼠，7-9周龄 实验试剂： MOG35-55 CFA 结核杆菌H37Ra 百日咳毒素 医用一次性三通管，医用玻璃注射器 IL-17、IL-23、IFN-γ、TNF-α、IL-17A 、 IL-6， IL-4、TGF-β、IL-33 ELISA kit EAE造模 1、小鼠购买后，饲养于室温22~26℃，湿度为52~56％的环境中，维持明——暗循环交替，并给予充足的食物和水。每日于同一时间称量小鼠并记录。适应性饲养一周后用于实验。 2、用0.01mol/LPBS将MOG35-55稀释为60mg/ML,然后加入等体积的CFA混合，用电动搅拌器充分搅拌乳化，直至乳化液滴入水中成油包水状。放置与4°C保存12 h。 3、称量小鼠体重，按0.1毫升/20g予以1%戊巴比妥钠麻醉，腹腔注射。再将油包水状抗原乳剂接种于小鼠脊柱两侧皮下，分四个部位，每个部位50微升，分别于免疫后第0及三天腹腔内注射百日咳500ng。 二、途径 机制：IL-6、TGF-β协同诱导IL-17促进IL-23，RORγt（调控IL-17mRNA的表达，是Th17细胞分化的关键性转录因子）的表达，从而利于Th17细胞的分化（产生后永久性存在），在IL-23的支持下分泌Th-17产生炎症效应（破坏血脑屏障，导致CNS炎症，杀死神经元细胞，轴突受损）. 假设EGCG可以上调CD4细胞上HO-1基因的表达，即上调HO（血红素加氧酶），HO-1可以抑制IL-6，阻止Th17细胞分化。 需测指标: 脊髓中 IL-17、IL-23、HO-1的mRNA水平。（实时定量PCR）。 外周血液中IL-6、IL-7浓度（ELISA检测）。 机制：①caspase-9是凋亡细胞的关键。假设EGCG能通过抑制cyt-c释放至细胞质，减少caspase-9的激活，进而降低线粒体途径凋亡的发生，发挥神经保护作用。 ②抗氧化反应元件NRF2是具有基本亮氨酸拉链结构的一种核转录因子。能抑制线粒体电传递链破坏造成的神经毒性，使小鼠对线粒体电子链复合物1、2更敏感，在神经组织中NRF2通路的激活可对抗线粒体复合物1抑制剂鱼藤酮和线粒体复合物1抑制剂3-硝基丙酸引起的线粒体应激，发挥神经保护作用。 需测指标及方法：①western blot检测线粒体凋亡通路特异性标记蛋白caspase-9的表达②western blot检测线粒体凋亡通路关键蛋白cyt-c的表达③western blot检测各组小鼠脊髓NRF2的表达④免疫组化检测各组小鼠NRF2的表达. 机制：已有研究显示中枢神经系统高表达IL-33，且IL-33可诱生Th2型细胞因子，从而导致Th1/Th2细胞偏离，发挥保护作用。在本课题中我们可假设EGCG能够增强IL-33分泌，从而对EAE疾病进程产生保护作用。 3.1检测指标首先借助逆转录PCR、实时定量PCR、western-blot、免疫组化检测正常小鼠、EAE小鼠及注射EGCG的EAE小鼠的脑、脊髓、肝脏IL-33表达水平及改变，用ELISA检测上清IFN-γ、IL-17、TNF-α水平。 机制：Th1主要分泌IFN-γ,在炎症初期诱导募集Th17,启动炎性反应。假设EGCG对该途径有抑制作用， 检测指标：IL-17A , IL-6mRNA的表达情况（实时荧光定量RT-PCR） IL-17A , IL-6 , INF-γ(ELISA试剂盒) 机制：Treg和Th17是两个在CD4T细胞分化过程中相互抑制的两个不同亚群，Treg主要分泌IL-10和TGF-β,可同时抑制Th17/Th1所介导的炎症反应。假设EGCG可以调控CD4T细胞分化成Th17/Th1或Treg的平衡，或诱导Treg表达Foxp3(转录因子)抑制Th17的分化。 检测指标: IL-17A , IL-6，Foxp3mRNA的表达情况（实时荧光定量RT-PCR） 脾淋巴细胞CD4+CD25+Treg/CD4+T的比例（流式细胞术） 外周血IL-17 , IL-4（ELISA试剂盒） Foxp3蛋白质的检测（western blot） 机制已有研究证明ICA（淫羊藿苷，中药）具有雌激素样作用，通过影响E2和ER的水平来缓解EAE的临床症状。ICA通过雌激素途径增加TGF-β水平发挥抗炎作用。①抑制对IL-2依赖的T细胞增殖；②抑制IL-2依赖的B细胞分泌IgM；③抑制细胞因子TNF-α产生。在实验之前假设EGCG也有雌激素样作用，可以促进小鼠体内雌激素分泌。 检测指标：①放射免疫法检测各组小鼠内源性雌激素E2水平。 ②ELISA检测小鼠血清中TGF-