DNA重组与转化.ppt

DNA重组与转化 一、实验目的 通过本实验学习重组DNA连接与转化的方法 二、实验原理 外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA连接 DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶 DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法，为了防止载体本身的自连，可以通过牛小肠碱性磷酸酶处理克服 连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。因此人们找到了一个折中的温度，即12～16℃，连接12～16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定 很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3’端加上一个突出的碱基A pUCm-T载体是用于克隆含有A末端PCR产物的理想载体。可以通过蓝白斑筛选有插入片段的重组克隆 pUCm-T载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3’端带有一个突出的T。这样，pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中，形成含有目的片段的重组载体 重组质粒转化宿主细胞后，还需对转化菌落进行筛选鉴定。利用α-互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法 α-互补：质粒载体上lacZ’基因编码的α-肽段与失去了正常氨基端的β-半乳糖苷酶突变受体菌之间实现互补的现象 由α-互补而形成的有功能活性的β-半乳糖苷酶，可以用X-gal显色测定出来 任何携带着lacZ’基因的质粒载体在转化β-半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞后，在含有X-gal的培养基平板上形成蓝色菌落，而含有重组质粒载体的克隆往往是白色菌落 三、仪器、材料与试剂 超净工作台 恒温培养箱 恒温摇床 台式离心机 移液枪（配套枪头） LB固体/液体培养基 X-gal IPTG 氨苄青霉素 pUCm-T Vector 玻璃涂棒 培养皿 离心管 四、实验步骤 在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为10μL 16℃连接反应30min 含有X-gal、IPTG、的LB琼脂平板培养基的制备：每块平板约20mL固体培养基（融化状态下加入20μL 100mg/mL Amp），在预制的LB琼脂平板上，加40μL X-gal （20mg/mL）和4μL IPTG（200mg/mL）溶液，用灭菌的玻璃涂棒均匀涂布于琼脂培养基表面（避光吸收） 实验组：将5μL连接产物加入至200μL DH5α感受态细胞中，冰中放置30min 阴性对照组：将5μL水加入至200μL DH5α感受态细胞中，冰中放置30min 42℃加热45s后，冰中放置1min 加入800μL LB液体培养基，37℃振荡培养60min 12000rpm离心5min，去掉800μL上清，混匀菌液，用灭菌玻璃涂棒涂布于含有X-gal、IPTG、Amp 的LB琼脂平板培养基上，37℃正置吸收30min 倒置平皿37℃培养过夜（12～16h）。在含有X-gal、IPTG、Amp的LB琼脂平板培养基上培养，形成单菌落 计数白色、蓝色菌落。挑选白色菌落，可使用菌落PCR法确认载体中插入片段的长度大小 五、思考题 如何克服载体自身连接的问题？ 利用α-互补进行蓝白斑筛选的原理是什么？ * * pUCm-T载体的图谱 转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程 2μL pUCm-T Vector（25ng/μL） 6μL 外源DNA 10μL 总体积 1μL T4 DNA连接酶 1μL Ligation Buffer ？ *