内毒素实验凝胶法解析.ppt

鲎试剂灵敏度复核试验 结果观察 将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°时，若管内形成凝胶，且不从管壁滑脱者为阳性；若不形成凝胶，或形成凝胶但倒转180°后从管壁滑脱者为阴性。 保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。 鲎试剂灵敏度复核试验 若最大浓度2.0λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc），计算方法见中国药典。 反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。 当λc在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。 凝胶法的试验步骤 下面我们结合中国药典2010、 GB 14233.2医用输液、输血、注射器具检验方法 以及GB 15810一次性无菌注射器 来学习具体试验方法。 实验步骤 浸提介质（细菌内毒素检查用水）体积计算公示： V－－浸提介质体积，单位为（ml）； L－－产品细菌内毒素限值（该产品允许含有的细菌内毒素的量），单位为EU/件； λ－－鲎试剂灵敏度的标示值，单位为EU/ml。 实验步骤 样品处理方法： a）管类和容器类器具用细菌内毒素检查用水浸泡器具内腔，在（37±1）℃恒温箱中孵育不少于1h，取浸提液进行试验； b）小型配件或实体类样品置无热源玻璃器皿内，加入细菌内毒素检查用水振荡数次，在（37±1）℃恒温箱中孵育不少于1h，取浸提液进行试验。 制备的供试液储存不应该超过2h。一般要求供试液的PH值在6.0~8.0之间，如不在该范围内，可用鲎试剂厂家提供的PH缓冲液调节浸提液的PH值。 实验步骤 结果观察 B、C溶液的反应管必须要阳性，就是轻轻倒转180度过来，鲎试剂安瓿里的反应溶液形成了凝胶体，不滑落。 而D溶液，就是细菌内毒素检查用水那2管，必须要阴性，3个条件都满足，就说明试验结果是可信的。最后看A溶液的反应情况： 阳性就说明原套器具每件大于20EU，判定为不合格； 阴性就说明小于20EU,结果是合格的； 1管阳性、1管阴性则要重新复查，复试时，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均为阴性则判断合格；否则判断为不合格。 注意事项 1. 每批鲎试剂在用于试验前首先要进行灵敏度的复核试验； 2. 安瓿开启前应先用砂石划痕(不管是色点或包环易折安瓿)，用手半拉半掰将颈部折断，千万不能用镊子敲击，防止碎玻屑掉入安瓿。 3. 在鲎试剂的溶解、样品的稀释及加入时，取样均应准确，缓缓加入避免气泡。 4. 保温过程中不可随时取出观察，防止形成的凝胶受到振动后变形而误判为阴性。 注意事项 5. 冻干的鲎试剂应存放在2-8℃下；避免长时间放置在高于25℃的温度条件下。已复溶的鲎试剂在间歇使用过程中最好放在2-8℃的冰箱里，可存放24小时，在-20℃以下，可存放四个星期，鲎试剂只能冻融一次。 三、操作注意事项 试验前准备： 1、玻璃器具应规范化，便于除热原、计量准确、清洗操作方便。 洗净 去污去内毒素 去洗涤剂 精洗 除外源性热原：250 ℃干烤至少1小时。 2、尽量用铝制器具和不锈钢用具，且用蒸馏水冲洗后250 ℃干烤至少1小时。 3、用于内毒素检测的稀释试管最好用玻璃试管；塑料用具只能为一次性且保证无内毒素。 实验环境：最好在洁净室或洁净工作台内进行，保证环境温度、湿度及通风稳定。 实验人员：用适宜的洗涤剂洗手，用75％酒精棉球消毒，戴工作帽和口罩。 实验过程： 1、内毒素工作标准品应严格按要求低温保存；工作标准品开封后尽快使用且应一次性用完，不再保存。 2、溶解后的标准品用封口膜封口后在漩涡振荡器上混匀15min；进一步稀释时每稀释一步均应在漩涡混合器上混匀30s。 振荡前 振荡后 内毒素分子在水溶液中的状态 3、每一步稀释液所用的移液器不能反复、交叉使用。 4、鲎试剂复溶时应将检查用水顺着瓶壁加入，避免产生气泡。 5、操作时间的长短。环境温度变化都会影响实验结果，故操作应尽量熟练、快速。 6、恒温器的温度变化应1℃，鲎试剂与样品混匀后应立即移入水浴槽，严格控制保温时间在60±2min，保温期间不得移动试管架，桌面保持平稳，周围不能有振颤因素。 7、使用的试管为10mm×75mm，10为试管外径。 结果判断：恒温结束后，取出试管或反应瓶缓缓倒转180°，不从管壁脱落为阳性，不能保持完整即使有部分脱落者也判为阴性。 其他：试剂