生化仪器与实验技术在药物质控中的应用试卷.pptVIP

电泳样品的处理 1 还原SDS处理 在样品溶液加入SDS，还原剂-巯基乙醇:4-5%,有臭味 DTT:2-3%,无味，不会影响其他样品，100℃ 3-5min, 有时还原剂可能被氧化，冷却后补加，以防蛋白质重新折叠和亚基的缔合，加入EDTA可防止DTT氧化。 2非还原SDS处理 在样品溶液加入1%SDS， 100℃ 3-5min, 二硫键未断裂，不完全去折叠。 3烷基化还原SDS处理 碘乙酰胺：保护巯基不被氧化，多巯基蛋白质测定的分子量略有增加。 蛋白印迹与免疫学测定 应用 原料与制剂中不同蛋白组分的鉴别与定量 方法与原理 将电泳分离的蛋白或多肽转移到固定基质上，以特异性抗体为探针，它与附着于固定基质上靶蛋白或多肽发生特异性反应，对蛋白或多肽电泳图谱上的特定组分进行定性定量分析。 实验步骤 电泳－转移－封闭－免疫检测 特点 将高分辨率的电泳技术与灵敏专一的免疫探测技术结合起来。灵敏度1-5ng，蛋白质或多肽条带不会扩散，操作简便，试剂用量少，便于对蛋白质或多肽进行各种分析。 关于实验上的一些考虑 1.电泳 ： SDS对被分离组分活性的影响 2.固相纸膜： NC膜 －常用0.45um，分子量小于20000时， 用小孔膜，0.1-0.2um。还有尼龙膜，重氮苄氧甲基纤维膜 3.转移：缓冲液－离子强度，pH值，稳定性， Towbin缓冲液：tris-甘氨酸，pH8.3，加甲醇20％ 甲醇作用：解离SDS蛋白复合物中的SDS，增强与膜 的结合能力。 电泳印迹－ 阳极－NC膜 －凝胶－阴极 垂直槽式：12Hr, 大量转移缓冲液，高场强，需冷却 （＋）－海绵垫－滤纸－NC膜－凝胶－滤纸－海绵垫－（－） 水平半干式：1.5-2h，低电流，少量转移缓冲液， （＋）板－滤纸－NC膜－凝胶－滤纸－版（－） 水平半干式转印 取6张滤纸浸泡于转移缓冲液中,取硝酸纤维膜(0.45μm)一张浸泡于去离子水中, 5~10min；用水淋洗石墨板,用纸巾擦干电极板上的液滴,将电泳后的胶片浸于转移缓冲液中。 依次放置阳极板→3层滤纸→硝酸纤维素膜→电泳胶片→3层滤纸→阴极板。 滤纸、纤维素膜和胶片应大小相同，每放一层要精确对齐,各层之间不留气泡。 以0.65mA/cm2设置电流, 恒流转移1-2hr, 关闭电源，停止转印。 4.封闭 用封闭试剂将膜上非蛋白结合区饱和，以减少非特异性结合，降低显色背景。 (2 m l封闭液/c m2 ) 封闭试剂：3%脱脂奶粉，BSA，明胶，加入0.3%吐温－20可改善封闭效果 5.蛋白多肽检测 非特异性检测 了解分离情况，转印效果 丽春红S染色－显色短，能被洗去，不影响免疫显色 印度墨水－总蛋白染色，显色久，便宜，灵敏度高 氨基黑10B，考马斯亮蓝－影响免疫显色 特异性检测 加 入蛋白或多肽的抗体溶液 , 4℃反应过夜 , 用Tris盐 溶 液 洗 膜 3次 , 每 次 10 m i n ；加 入 酶 标 抗 体 溶 液 ，置 室 温 反 应1－2 h r，洗 膜 同 前。取 出 膜 置 显 色 液中,室温下显色，至 出 现 色 斑 ，用 水 漂 洗 ，观 察 结 果 。 标记酶 底物 显色 特点 碱性磷酸酶 BCIP/NBT 蓝紫色 显色久 辣根过氧化物酶 DAB 棕色 色易退 BCIP ：5－溴4－氯－3－吲哚磷酸 NBT： 氮蓝四唑 DAB： 3，3－二氨基联苯胺 甲状旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）是维持机体血钙平衡的重要激素之一，其基本生理作用是通过增加成骨细胞及破骨细胞数目，促进骨吸收及生长。大量临床应用研究表明，PTH是目前治疗骨质疏松症的最重要药物之一 。 目前应用于临床研究的主要有hPTH (1-84)、(1-38)及(1-34)片段，均为基因工程产品。 有关此类产品的质控方法 研究重点： 生物学活性 肽含量测定 国际标准品 同一性鉴别 杂质