生化分离技术试卷.pptVIP

DNA,RNA和蛋白质的提取 学生：徐泽彬 专业：生物化工 学号：201306032 生物大分子 与化学产品相比，生物大分子的制备有以下主要特点： ⑴生物材料的组成极其复杂，有数百种至几千种化合物。 ⑵生物大分子的含量极微，分离纯化的步骤繁多，流程长。 ⑶生物大分子离开了生物体内的环境极易失活，因此如何防止其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。 ⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。 核酸提取的历史 核酸提取的历史 核酸提取的历史 核酸传统提取方法——TRIzol法 异硫氰酸胍/苯酚法（TRIzol法） 原理： 核酸在中性条件下，因磷酸基解离而带负电荷，这一部分由于水化而溶于水。而在酸性条件下，磷酸基的负电荷消失，水溶性下降。因此，在酸性酚的处理下，DNA向疏水性的酚层移动，而RNA由于有-OH的存在有亲水性，因此向水层移动。 核酸传统提取方法——TRIzol法 TRIzol试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA便分离开。水相层主要为RNA，有机层主要为DNA和蛋白质。 核酸传统提取方法——SDS法 SDS法原理 SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀； 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。 核酸传统提取方法——SDS法 核酸传统提取方法——CTAB法 CTAB法原理（植物DNA提取经典方法） CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。 该复合物在高盐溶液中（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。 核酸传统提取方法——CTAB法 Tris-HCl （pH 8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏 EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性 NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中 CTAB 溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离 β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除 核酸传统提取方法——CTAB法 核酸传统提取方法——EB-CsCl密度梯度离心法 核酸传统提取方法——EB-CsCl密度梯度离心法 核酸传统提取方法——EB-CsCl密度梯度离心法 核酸传统提取方法——oligo(dT)-纤维素柱层析法 核酸固相提取方法 核酸固相提取方法——二氧化硅基质法 二氧化硅基质法 二氧化硅基质提取的基本原理：带负电荷的DNA和带正电的二氧化硅粒子有很高的亲和力。在高盐的酸性条件下，DNA与二氧化硅紧密结合，先洗涤除去其他杂质，再用低离子强度的TE缓冲液或蒸馏水洗脱结合的DNA分子。 核酸固相提取方法——二氧化硅基质法 核酸固相提取方法——二氧化硅基质法 核酸固相提取方法——玻璃颗粒 核酸固相提取方法——硅藻土 硅藻土 硅藻土中二氧化硅的含量高达94% , 它一直被应用于过滤和层析。在离液盐 存在的 情况下, 它可将 DNA固定在其颗 粒表面, 因此也可用于DNA的纯化。 所得到的硅藻土与DNA结合物用含醇的缓冲溶液处理，从而DNA被洗脱出来。 核酸固相提取方法——磁性颗粒 磁性颗粒 磁珠法核酸纯化技术采用了纳米级磁珠微珠，这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团，能同核酸发生吸附反应。硅磁（Magnetic Silica Particle）就是指磁珠微珠表面包裹一层硅材料，来吸附核酸，其纯化原理类型于玻璃奶的纯化方式。离心磁珠是指磁珠微珠表面包裹了一层可发生离心交换的材料（如DEAE，COOH）等，从而达到吸附核酸目的。不同性质的磁珠微珠所对应的纯化原理是不一致。使用磁珠法来纯化核酸的最大优点就是自动化。磁珠在