生化技术：1生命大分子物质的制备试卷.ppt

目 的 掌握材料的选择与处理及确立测定方法 掌握细胞的破碎、抽提、浓缩 熟悉纯化方案的设计与评价 生物材料的特点 有效成分含量一般较低 有效成分稳定性较差 选用的材料不同，有效成分的含量就不同；即使选用的材料相同，不同的部位和生长时期，其有效成分的含量也不尽相同 材料选择原则 有效成分含量高，稳定性好 材料来源丰富，保持新鲜 提取工艺简单 有综合利用价值 实际工作中，不能硬套原则，要视实际情况而定 除脂方法 人工剥离 用脂溶性有机溶剂脱脂 热处理冷藏法（速热到50 ℃左右，然后速冷却），使其结块而除去 运用油脂分离器分离 （二）植物组织 茎叶等洗净即可使用，或快速放置-4~30℃储藏备用；若为种子，则需泡胀或粉碎才使用（油脂较多的也需脱脂处理） （三）微生物 由于具有种类多、繁殖快、培养简单、诱变容易和不受季节影响等优点，现已成为制备生命大分子物质的主要材料之一 上清：制备胞外酶和辅基等成分 培养液 离心 菌体：破壁后提取胞内成分 一、目的要求 目的：1.确定生物材料 2.确定提取纯化方法的有效性 （一）光谱法 1.吸收光谱法 直接测定：将待测物配成一定浓度的溶液，在一定波 长处用分光光度计测定其含量 如测定核酸含量：双链DNA：50μg/ml；单链DNA：３７μg/ml； 　　　　　　　　单链ＲNA：４０μg/ml；A260=1 纯度测定:纯DNA A260/A280 =1.8;纯RNA A260/A280 =2.0 (若DNA A260/A280 1.8或2.0,说明有蛋白质混入) 比色法:将待测物与相关试剂或酶的底物作用产生具有 特定颜色的物质,通过测定有色物质的A值对待 测物定量或测定酶的活性 2.荧光法 3.浊度法 （二）电化学法 常用方法 机械破碎（研磨法、组织器捣碎法、超声波法、压榨法和冻融法） 溶胀和自溶 化学处理 生物酶降解 特点：精确、灵敏（10-9~-10）、重复性好 如AST的测定：ASP+α-酮戊二酸 草酰乙酸+Glu 草酰乙酸+NADH+H+ L-苹果酸+NAD+ AST活力测定就是通过测定在340nm（NADH）处的A值下降量 AST MDH 主要对稀悬浮液进行测定 如：半刀豆球蛋白活力测定 —A420 培养液中细菌浓度测定— A600 用pH计或酸碱滴定进行测定 （三）生物活性检测法 根据生命活性物质用于实验动物身上引起的变化对生命活性物质进行检测 如：HCG能使小鼠子宫加速增殖，故通过注入HCG后检测小鼠子宫的变化来推测HCG 的生物活性 （四）免疫分析法 利用Ag-Ab特异反应，并结合放射性同位素标记或酶标记，对有关物质灵敏定性或定量 如：酶联免疫吸附法 （五）生物传感器 利用生物传感器的 敏感膜与待测液中某一成分进行反应，来显示有效成分的数量 几种测定蛋白质和核酸含量的方法 第三节 细胞的破碎 有效成分有的存在于“材料”细胞外，有的存在于细胞内。就原核细胞而言，若有效成分分泌到细胞外（如淀粉酶类、水解酶类），则分离培养液上清，用相应试剂和方法即可提取制备；若有效成分存在于细胞内（如氧化还原酶类），则需破碎细胞，再进行提取 但也有例外，如从铜绿假单胞菌中提取ALP时，可不破细胞，用含0.2mol/LMgCl2的0.01mol/LTris-HCl缓冲液（pH8.4）或0.2mol/LMgCl2的溶液（pH8.4）进行抽提（提取酶蛋白后的细菌细胞，可继续培养） 一般动物脏器的细胞膜比较脆弱，极易破碎，往往在组织绞碎或提取时就破坏了，而植物和微生物的细胞壁较牢固，需提前进行专门的破细胞操作 一、机械破碎 1.研磨法：将剪碎的动物组织置研钵中，用研磨棒研 磨。为提高研磨效率，也可加入一定量的石 英砂（注意“吸附”）。大规模生产时，可 用电动研磨法（如球磨机） 此法为温和破碎，适用于动物细胞和细菌细胞的破碎 2.组织捣碎器法：捣碎器（8000~10000r/min）处理30~45S, 植物和动物细胞可完全破碎，但对微