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小鼠骨髓细胞微核试验 In vivo Mouse Bone Marrow Cytogenetics Test Micronuleus Assay 食品毒理学 一、实验目的 掌握哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验的原理和方法 了解微核试验的意义及应用 二、实验原理 微核（ micronucleus） 细胞主核之外，大小为细胞直径1/20-1/5 圆形或杏仁形，边缘光滑整齐 染色与主核一致 一个细胞内可以存在一个或多个微核 二、实验原理 微核成因 染色体或染色单体的无着丝点断片 纺锤丝受损而丢失的整个染色体 细胞分裂后期遗留在胞质中，单独形成规则的次核 植物细胞微核实验（蚕豆根尖） 淋巴细胞微核实验 双核微核实验 小鼠骨髓微核实验 嗜多染红细胞（PCE） 嗜多染红细胞是分裂后期的红细胞，由幼年发展为成熟红细胞的一个阶段 特点： 1.无主核、易识别微核（有核细胞中微核与正常核叶及核的突起难以鉴别） 2.胞内含核糖体，染色后成灰蓝色（区别于成熟红细胞，其无核糖体、染色呈淡橘红色） 3.骨髓中PCE数量充足，满足实验计数的要求 三、意义及应用 检测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点。 检测能使染色体发生断裂或使染色体和纺锤体联结损伤的化学物（DNA断裂剂和非整倍体诱变剂）。 辐射损伤、化学诱变剂、新药试验、染色体遗传疾病及癌症前期诊断等各方面。 四、器材及试剂 器材：手术剪、无齿镊、小型弯止血钳、干净纱布、带橡皮头吸管、晾片架、玻璃蜡笔、玻璃染色缸、载玻片及推片、定时钟、带油镜头显微镜、细胞计数器 试剂：小牛血清、生理盐水、Giemsa贮备液 五、操作步骤 实验动物的选择及处理 动物选择：大、小鼠，小鼠最常用，18-20g，7~12周龄， 每组10只，雌雄各半。 剂量选择：以1/5 LD50为最高剂量组，下设3-4个剂量组，同时设阳 性和阴性对照。 染毒途径：经口、经皮、经呼吸道、注射。 染毒次数：多次染毒法（每天染毒一次，连续4天，第五天取样） 两次染毒法（第一次染毒24h后进行第二次染毒，6h取样） 五、操作步骤 本次实验染毒处理： 环磷酰胺 剂量：0.8mg/10g 每次染毒(腹腔注射） 次数：多次染毒法（4次）----最佳浓度及作用时间 五、操作步骤 骨髓液制备 ↓ 涂片 ↓ 染色 ↓ 观察与计数 五、操作步骤 骨髓液制备及涂片 猝死：颈椎脱臼、麻醉 取组织：胸骨、股骨 获取骨髓液：在胎牛血清中迅速制取骨髓液 涂片：均匀 五、操作步骤 染色 涂片充分晾干后 染色：1. 平置涂片于染色架上，滴加试剂一5滴， 迅速均匀盖满涂片，染色1.5 min 2. 不要丢弃试剂一，直接滴加试剂二10滴，轻轻均匀摇晃涂片使染液均匀覆盖涂片，染色8 min 3. 水洗涂片30s, 待干后镜检 五、操作步骤 观察 显微镜的使用 低倍镜：细胞群 高倍镜：分布均匀、染色良好 油镜：细胞形态、微核 观察 镜下有3种细胞： PCE: 灰蓝色 NCE： 橘黄色 有核细胞：蓝紫色 微核： 蓝紫色、 圆形、 边缘规则 五、操作步骤 五、操作步骤 计数及结果分析 1. 总共200个细胞中，计数PCE与NCE的比值 正常范围 0.6-1.2 PCE/NCE评价细胞毒性的指标 P值具有统计学意义：受试化学物剂量过大，PCE形成受 到严重抑制，实验结果不可靠 2. 微核率：含有微核的嗜多染红细胞数，以千分率（‰）表示 （若一个PCE中出现两个或两个以上微核，仍按有一个微核细胞计数） 3.阴性对照组和阳性对照组的微核发生率，根据实验对象的不同，应与相关文献报道或研究历史数据相一致。 4.统计分析（Poinsson分布、二项分布、X2检验等）试验组微核率与阴性对照组相比有显著差异时，可认为受试物为具有遗传毒性。 骨髓微核观察的步骤 取胸骨 擦净血污，剔去肌肉 剪去骨骺端 小牛血清 混匀、推片 晾干 Giemsa应用液 反面