通过向卵母细胞中注入孤雄单倍体胚胎干细胞获得转基因小鼠的传代解剖.ppt

通过向卵母细胞中注入孤雄单倍体胚胎干细胞获得转基因小鼠的传代 Hui Yang,1,6 Linyu Shi,1,6 Bang-An Wang,2,6 Dan Liang,1 Cuiqing Zhong,1 Wei Liu,2 Yongzhan Nie,4 Jie Liu,4 Jing Zhao,5Xiang Gao,5 Dangsheng Li,3 Guo-Liang Xu,2,* and Jinsong Li1,* 杨辉…………李党生、徐国良、李劲松（cell） 首先引入本文献一些生物学专业名词 一、前 言 在有性生殖的生物中，单倍体配子——卵细胞和精子，可以将基因传递给下一代。然而，由于卵细胞和精子的结构和功能已经特化，不能在体外进行长期稳定的繁殖培养，也就无法进行基因操作和筛选。因此，需要建立单倍体细胞系，在体外进行培养，代替配子构建动物模型。最近三十年间，老鼠单倍体胚胎已经采用不同的策略获得，但从这些胚胎中建立的胚胎干细胞却最终变成双倍体。在人类中，接近于单倍体的细胞系来自于肿瘤，但由于存在基因突变而不能形成稳定的单倍体基因组。近期，相对稳定的单倍体胚胎干细胞来自小鼠的孤雌胚胎，可以用于遗传正反向筛选，并可使用荧光激活细胞分类仪对该类单倍体细胞进行富集。然而，研究结果并未显示，得到的小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞是否能够嵌合到生殖系。如果不能，就不能将基因性状传递给下一代，基因研究工作就只停留在细胞水平，无法上升至动物水平。 基于此，本研究小组设想，如果在体外能够获得孤雄单倍体胚胎干细胞系，同时能维持很好的孤雄印记，那么，这些单倍体细胞就可能取代精子，在注入卵母细胞后得到正常的小鼠个体。在本研究中，我们建立了从孤雄囊胚中诱导haESCs的方法，且haESCs在各项检验指标中均显示出具有发展潜能。更重要的是，这些AG-haESCs可以注入到卵母细胞中形成正常的可以传代的小鼠。 三、文章结构框架流程图 主要通过6幅图展开 1.从孤雄囊胚 中诱导 AG-haESC细胞系 2.验证 AG-haESCs的多能性 3.检测AG-haESCs父系印迹状态 4.检测AG-haESCs注入卵细胞后胚胎发育结果 5.验证基因性状可从 AG-haESCs传递至 SC小鼠后代 6.在 AG-haESCs中可进行基因操作 图1.从孤雄囊胚 中诱导 AG-haESC细胞系 图2.验证 AG-haESCs的多能性 图3. AG-haESCs父系印迹状态 图4.显示 AG-haESCs注入卵细胞后胚胎发育结果 图5.基因性状从 AG-haESCs传递至 SC小鼠后代 图6.在 AG-haESCs中进行基因操作 四、结论 1. 成功实现了从孤雄囊胚中诱导建立孤雄单倍体胚胎干细胞系（AG-haESCs）的方法； 2. 验证了得到的AG-haESCs具有多能性；可以维持父本印记；并能代替精子，在注入成熟卵母细胞后培育成健康的可以传代的小鼠，该半克隆小鼠和正常受精卵发育而来的小鼠一样，能够实现性状的传递。 3. AG-haESCs还便于进行基因操作。因为对于具有二倍体基因组的高等生物来说，想要进行某个基因功能的研究并非易事，需要对两个等位基因同时进行相同操作，而AG-haESCs仅对一条染色体操作即可，且该细胞能够在体外长期稳定扩增培养，实现传代，为更有效、更快捷地获得基因改造动物提供了新的思路。 图 6A 为针对 Vwce 基因的同源重组打靶策略。编码外显子由黑色方框标示，1号外显子的 5‘非编码区部分由空白方框标示，位于 neo筛选标志一侧的 Frt位点用空白三角标示，靶向区域旁的 loxΡ位点用灰色三角标示，用于 AG-haESCs克隆基因型鉴定的引物在图中用水平箭头标示，打靶正确的 haESC克隆用引物 1 P1 和引物 2 P2X跨越左臂区域 、引物3 P3 和引物 4 P4X跨越右臂区域 将会产生 4.9kb和 5.6kb的片段； 图 6B 显示药物筛选获得的 AG-haESC细胞株中抽提出 DNA后 PCR鉴定其基因型的结果，左边标示的是所用的引物，一个正常的被打靶的两倍体ES被作为对照来展示两条等位基因 第一列）,一个未打靶的 AG-haESC细胞株被做为阴性对照 第二列）,其中,targeted diploid 表示被打靶的两倍体，untargeted 为未被打靶； 图 6C 显示扩增打靶成功的 AG-haESC-Vwce细胞株，以获得稳定的单倍体细胞群。 * * 汇报人：付玮玮 1.AG-haESCs： Androgenetic Haploid Embryonic Stem Cells ，孤 雄单倍体胚胎干细胞； 2.ICAHCI： intracytoplasmic AG-haESC injection