王镜岩生物化学经典DNA复制和重组解剖.ppt

噬菌体的基因重组 (三) 重组有关的酶 依赖RecBCD起始的重组模型: RecBCD有依赖ATP的核酸外切酶、核酸内切酶和解螺旋酶活性，当DNA断裂时，它结合在其游离端，使其解旋并降解，直至酶移动到chi位点（GCTGGTGG)，在其3＇侧4-6核苷酸处将链切断，产生3＇游离单链，随后单链与RecA结合，开始同源区重组。 RecA蛋白的丝状聚合体与DNA的相互作用 RecA蛋白的带状图解 RecA蛋白的丝状聚合体，每一圈螺旋由6个RecA蛋白单体构成，其中一个单体由红色标出。 RecA蛋白引起DNA同源重组的模型 在大肠杆菌中由RuvA,RuvB和RuvC蛋白参与的同源重组。 （a） RuvA四聚体的图解。四个亚基形成的结构像四个花瓣的花。 （b） RuvA/RuvB的作用： （左）RuvA四聚体结合到Holliday位点； （中）RuvB六聚体结合到杂合双螺旋的两对面，DNA穿过其中心， RuvB六聚体的作用像马达，促进超螺旋分叉点通过复合体移动。 （右）RuvC结合到Holliday位点，由其核酸酶活性切断核酸链，切割位点由剪切体辨认。 （c） RuvA四聚体的电荷分布，蓝色表示正电荷，红色表示负电荷，注意正电荷位于四聚体的表面，有四个负电荷区域位于其中心。 （d） 假设的RuvA四聚体与Holliday位点结合的结构模型。 二、特异位点重组 Model of in vitro replication of SV40 DNA by eukaryotic enzymes: 1. T antigen (Tag) binds and unwinds replication origin; 2. RPA (or RFA) binds to single-stranded DNA; 3. Pol α-primase synthesizes the primers (RNA + DNA). 4. RFC loads PCNA to the template. 5. PCNA displaces Polα-primase and functions as a DNA clamp; 6. Pol δ replaces Polα-primase and further extends the DNA strands. 酵母的自主复制区 多个ARS(autonomously replicationg sequence)发挥复制起点的功能。 酵母染色体Ⅳ的着丝粒附近为ARS1序列，ARS1分为A,B,C三个功能区, A,B起主要作用,C起次要作用。A区为15bp,其中11个保守，称ACS (ARS consensus sequence)。有复制起始子的功能。B区约为80bp,含B1,B2,B3三个功能区。B3是ABF1（ARS-binding factor 1）结合区。 ORC(origin recognizing complex)：由6个亚基组成相当于DnaA和λ的O蛋白，与A/B1结合后结合于游离的DNA。 Cdc6:相当于DnaC,及λ的P蛋白，使Mcm蛋白结合到复合体上。这对于在Origin上起始复制是必须的。 Mcm: DnaB螺旋酶。即 licensing factor ABF1：（转录因子）结合于B3 酵母DNA复制的起始 起点辨认复合体 由酵母cdc6基因编码的复制激活体蛋白 小染色体维持蛋白（复制许可因子） 周期蛋白-周期蛋白依赖性蛋白激酶 由酵母cdc7,dbf4基因编码的另一种蛋白激酶 前复制复合体 后复制复合体 PCNA（增殖细胞核抗原）三聚体的结构与原核生物DNA聚合酶? 的β亚基二聚体相似。 真核生物DNA复制的模式 复制蛋白A 复制因子C (a)前导链的合成由DNA聚合酶α起始，然后RFC除去DNA聚合酶α，结合PCNA和DNA聚合酶δ（图中未示出），滞后链的合成由DNA聚合酶α起始合成引物，然后由RFC装载PCNA和DNA聚合酶δ（或ε），合成冈崎片段。 （b）当DNA聚合酶接近下游冈崎片段的RNA引物时，RNase H1降解RNA引物到最后一个核苷酸，最后一个核苷酸由FEN1/RTH1切除，连接酶连接两个冈崎片段断。 滞后链末端的引物被切除后会形成缺口 端粒酶可以加长DNA的末端 二、DNA的损伤修复 (一) 错配修复 大肠杆菌的Dam甲基化酶可以使DNA的GATC序列中A的N6甲基化，新合成的链在短期内未能甲基化，如果有错配碱基对，则需切除新合成链的错配区，MutS二聚体识别并结合到错配碱基部位，mutL二聚体与MutS结合，