第5章核酸的化学解析.ppt

（三） Southern印迹法 分子生物学技术 用于检测DNA 方法：如图 Northern 印迹法：用于检测RNA （四）聚合酶链  式反应（polymeerase chain reaction, PCR) 聚合酶链式反应（PCR） 每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍 30轮循环可获得—— 230（1.07×109)个基因片段 应用： 广泛用于克隆、测序、产生特异突变、医学诊断和法医. 原理： 碱基配对； 聚合酶可催化在试管内合成与模板互补的 DNA新链； 双脱氧核苷酸无3’-OH，合成到此终止； 可电泳分离随机得到的大小不等的片段。 （五）核酸序列测定 核酸序列测定 * 1）tRNA结构： 一级结构多已清楚， 含较多稀有碱基； 二级结构为三叶草 有：aa臂、 二氢嘧啶环、 反密码环、 可变环、 TΨ 环 P198 RNA 主要特征： 1.四臂四环； 2.氨基酸臂3′端有CCAOH的共有结构；3.D环上有二氢尿嘧啶（D）； 4.反密码环上的反密码子与mRNA相互作用；5.可变环上的核苷酸数目可以变动； 6.TψC环含有T和ψ；7.含有修饰碱基和不变核苷酸。 tRNA 三级结构 为倒L型 A、在pr合成中转运aa； B、在pr合成的起始、DNA反转录合成及其它代谢调节中起作用。 2）tRNA功能： 2、mRNA和hnRNA 1）合成： 以DNA为模板(核内) 合成 hnRNA（含内含子和外显子） 加工 成熟的mRNA 入细胞质 蛋白质合成 RNA 合成mRNA 切除内含子 2) mRNA结构特点： 3‘末端有polyA结构：与mRNA从核入质有关。 5‘末端有帽子结构：G被甲基化，此可能与pro合成的起始有关。 3) 功能：是蛋白质合成的模板 3、rRNA 1)占RNA总量的80%，是构成核糖体的骨架。 2)核糖体功能： pr合成的部位. 3）结构：分大、小亚基 一、二级结构多已确定，但功能不清。 RNA 原核细胞：70S核糖体； 真核细胞：80S核糖体； 核糖体RNA自我剪切 1983年在四 膜虫中发现 RNA有催化功能 4、RNA的功能 1）在DNA复制、转录、翻译中起重要调控 作用； 2）有催化作用； 3）可作为遗传物质（如逆转录病毒）。 RNA 五、核酸的性质 （一）一般理化性质 1、两性电解质： 2、溶解性：微溶于水，不溶于一般有机试剂（乙醇沉淀核酸），钠盐易溶于水。 0.14摩尔法:分离DNA蛋白和RNA蛋白的方法 DNA蛋白:在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最低. RNA蛋白:在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度较大. 3、粘度高：一般DNA比RNA粘度高。 4、水解性：可被酸、碱或酶水解，DNA比 RNA对稀碱稳定。 核酸的性质 5、颜色反应： 1）核糖与浓盐酸和苔黑酚(甲基间苯二酚)共热呈绿色，在 670nm处可测RNA； 2）2-脱氧核糖与酸和二苯胺共热呈蓝紫色， 在595nm处可测DNA。 二种反应可作定性试验，定量试验灵敏度低、准确性差，但快、简便。 核酸的性质 （二）紫外吸收性质 碱基具共轭双键强烈吸收260-290nm波段 紫外光，最大吸收峰在260nm附近。 应用： 1、不同核苷酸有不同吸收特性，可用紫外分光光度计进行定性、定量测定。 1 OD相当于：50μg/ml DNA 40μg/ml RNA 核酸的性质 2、确定所提取的核酸是否纯品。 1）DNA： OD260/OD280 ≈1.8 纯品 2）RNA： OD260/OD280 ≈2.0 纯品 在纯化DNA 时,通常用A260/A280=1.8- 2.0 作为纯度标准,若大于此值,表示有RNA 污染;若小于此值,则有pro 或酚污染. 核酸的性质 （三）核酸结构的稳定性 1、碱基堆积力：双螺旋内部碱基形成的疏