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RuBPCase活性测定技术 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶 (E.C. 4.1.1.39) 14C放射性同位素示踪法 目 录 Rubisco的发现和催化反应 Rubisco 的亚基组成 Rubisco的体内外活化 Rubisco的活性测定方法 放射性同位素的使用和注意事项 1. Rubisco的发现和催化反应 1950s Wildman SG Fraction I protein 1954 Calvin RuBPCase purified 1968 Kawashima Fraction I protein crystallization Fraction I protein RuBPCase 1970s RuBPOase found 《Nature》、《Science》上文章认为它是光合作用的限速酶,甚至是产量的限速酶! RuBPCase催化反应 以上两个反应为竞争性反应 Ω:特征因子 受酶一级序列和构象影响 8ruc active site Ω 特征因子 特征因子越大,利用低CO2的能力越强;对于C3植物有重要意义; 生物越低等,特征因子越小; 一般高等植物的特征因子50-100,目前自然界发现最高的为海洋红藻的Rubisco,特征因子为210左右; Vmax同Ω很难兼得。 低效率的酶 Turnover number 转换数 CAT: 10000 RuBPCase: 3-4 Site-directed mutation Spreizter等试图分子改造 2. Rubisco的亚基组成 Form I: L8S8 高等植物 Form II: L2 n 光合细菌 Form III: 古核生物 LSU叶绿体编码;SSU细胞核编码; 自然界最丰富的蛋白质 Rubisco在叶绿体中含量达到300mg/ml 3. Rubisco的体内外活化 active form inactive form in vitro activation 用于活化的CO2不同于参与反应的CO2 Mg2+:20mM ACO2: 10mM NaHCO3 植物体内无法实现! 初始活性 initial activity 总活性 total activity 活化率 in vivo activation 1980s 拟南芥突变体 只在5% CO2生存 dif-2D电泳发现: 突变体少47、50kDa两条蛋白带 鉴定为Rubisco activase RuBPCase体内活化由该酶负责! 白天activase利用光合作用“光反应”制造的ATP活化Rubisco;activase不耐高温,对于C4植物是光合作用的重要限速酶。 4. Rubisco的活性测定方法 酶活性的定义 RuBPCase活性常用测定方法 偶联酶方法 14C放射性同位素方法 测定单位时间内产物14PGA的增加。 通过供给14C标记的底物CO2实现。 放射性底物14CO2通过NaH14CO3提供; RuBPCase预先体外活化; 反应在30°C下进行; 未反应的14CO2用挥发性强酸HCl释放到大气中; 最后留在闪烁瓶中的放射性完全来自14PGA; 放射性强度用液体闪烁计数器测定。 试剂 研磨介质:pH7.7缓冲液为主; 固定介质:100mM HEPES, 20mM KCl, 80mM MgCl2, 12mM NaHCO3, 1mM DTT NaH14CO3溶液; RuBP溶液; 中止液:4N HCl 闪烁液 步骤 粗酶液的制备 称取0.2g左右的绿色功能叶片,加入2ml研磨介质研磨匀浆,再用2ml冲洗研钵,一起离心(10000 x g),取上清用小量筒测定体积,冰浴上待用。 步骤 初始活性的测定 1)往闪烁瓶中加入500μl固定介质,放到水浴锅中保温; 2)用微量进样器吸取10 μl RuBP溶液加入到闪烁瓶中; 3)用专用的微量进样器取10 μl NaH14CO3溶液加入到闪烁瓶中; 4)保温5min; 5)加入100 μl粗酶液启动反应,并开始计时; 6)45s时加入500 μl 中止液停止反应; 7)烘干;。。。。。。 步骤 总活性的测定 1)往闪烁瓶中加入500μl固定介质,放到水浴锅中保温; 2)加入100 μl粗酶液; 3)保温5min ; 4)用专用的微量进样器取10 μl NaH14CO3溶液加入到闪烁瓶中; 5)用微量进样器吸取10 μl RuBP溶液加入到闪烁瓶中启动反应,并开始计时; 6)45s时加入500 μl 中止液停止反应; 7)烘干;。。。。。。 活性计算 Dpmck:本底对照(不加粗酶液) 比
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