研究生实验-RuBPCase活性测定技术重点分析.ppt

RuBPCase活性测定技术 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶 （E.C. 4.1.1.39） 14C放射性同位素示踪法 目 录 Rubisco的发现和催化反应 Rubisco 的亚基组成 Rubisco的体内外活化 Rubisco的活性测定方法 放射性同位素的使用和注意事项 1. Rubisco的发现和催化反应 1950s Wildman SG Fraction I protein 1954 Calvin RuBPCase purified 1968 Kawashima Fraction I protein crystallization Fraction I protein RuBPCase 1970s RuBPOase found 《Nature》、《Science》上文章认为它是光合作用的限速酶，甚至是产量的限速酶！ RuBPCase催化反应 以上两个反应为竞争性反应 Ω：特征因子 受酶一级序列和构象影响 8ruc active site Ω 特征因子 特征因子越大，利用低CO2的能力越强；对于C3植物有重要意义； 生物越低等，特征因子越小； 一般高等植物的特征因子50－100，目前自然界发现最高的为海洋红藻的Rubisco，特征因子为210左右； Vmax同Ω很难兼得。 低效率的酶 Turnover number 转换数 CAT: 10000 RuBPCase: 3－4 Site-directed mutation Spreizter等试图分子改造 2. Rubisco的亚基组成 Form I: L8S8 高等植物 Form II: L2 n 光合细菌 Form III: 古核生物 LSU叶绿体编码；SSU细胞核编码； 自然界最丰富的蛋白质 Rubisco在叶绿体中含量达到300mg/ml 3. Rubisco的体内外活化 active form inactive form in vitro activation 用于活化的CO2不同于参与反应的CO2 Mg2+：20mM ACO2: 10mM NaHCO3 植物体内无法实现！ 初始活性 initial activity 总活性 total activity 活化率 in vivo activation 1980s 拟南芥突变体 只在5％ CO2生存 dif-2D电泳发现： 突变体少47、50kDa两条蛋白带 鉴定为Rubisco activase RuBPCase体内活化由该酶负责！ 白天activase利用光合作用“光反应”制造的ATP活化Rubisco；activase不耐高温，对于C4植物是光合作用的重要限速酶。 4. Rubisco的活性测定方法 酶活性的定义 RuBPCase活性常用测定方法 偶联酶方法 14C放射性同位素方法 测定单位时间内产物14PGA的增加。 通过供给14C标记的底物CO2实现。 放射性底物14CO2通过NaH14CO3提供； RuBPCase预先体外活化； 反应在30°C下进行； 未反应的14CO2用挥发性强酸HCl释放到大气中； 最后留在闪烁瓶中的放射性完全来自14PGA； 放射性强度用液体闪烁计数器测定。 试剂 研磨介质：pH7.7缓冲液为主； 固定介质：100mM HEPES, 20mM KCl, 80mM MgCl2, 12mM NaHCO3, 1mM DTT NaH14CO3溶液； RuBP溶液； 中止液：4N HCl 闪烁液 步骤 粗酶液的制备 称取0.2g左右的绿色功能叶片，加入2ml研磨介质研磨匀浆，再用2ml冲洗研钵，一起离心（10000 x g），取上清用小量筒测定体积，冰浴上待用。 步骤 初始活性的测定 1）往闪烁瓶中加入500μl固定介质，放到水浴锅中保温； 2）用微量进样器吸取10 μl RuBP溶液加入到闪烁瓶中； 3）用专用的微量进样器取10 μl NaH14CO3溶液加入到闪烁瓶中； 4）保温5min； 5）加入100 μl粗酶液启动反应，并开始计时； 6）45s时加入500 μl 中止液停止反应； 7）烘干；。。。。。。 步骤 总活性的测定 1）往闪烁瓶中加入500μl固定介质，放到水浴锅中保温； 2）加入100 μl粗酶液； 3）保温5min ； 4）用专用的微量进样器取10 μl NaH14CO3溶液加入到闪烁瓶中； 5）用微量进样器吸取10 μl RuBP溶液加入到闪烁瓶中启动反应，并开始计时； 6）45s时加入500 μl 中止液停止反应； 7）烘干；。。。。。。 活性计算 Dpmck：本底对照（不加粗酶液） 比