遗传实验11、12诱变物质的微核测试(综合)详解.ppt

 实验原理 微核（Micronucleus，MN）：当染色体受到损伤后，染色单体或染色体的无着丝粒断片，或因纺锤体受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期，仍然游离在细胞质中。末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在子细胞的胞质内，因比主核小，故称为微核。 微核试验（Micronucleus test，MNT） ：凡能使染色体发生断裂或使染色体和纺锤体联结有损伤的化学物，都可用微核试验来检测。各种类型的骨髓细胞都可形成微核，但有核细胞的胞质少，微核与正常核叶及核的突起物难以鉴别。所以多用无主核的细胞来进行微核试验。 嗜多染红细胞（polychromatic erythrocyte，PCE）： 是分裂后期，处于幼年红细胞向成熟红细胞发展中间阶段的一群红细胞。此时的红细胞主核已排出，但因胞质内含有核糖体，用姬姆萨染色呈灰蓝色；成熟红细胞的核糖体已消失，则被染成橘红色；而幼红细胞则有较大的核，且被染成紫红色。骨髓中嗜多染红细胞数量充足，微核被染成紫红色或蓝紫色，很容易辨认，而且微核自发率低。因此，骨髓中嗜多染红细胞成为微核试验的首选细胞群。 实验目的 1、了解微核发生的机制； 2、掌握微核实验的一般程序和实践意义； 3、掌握对实验动物进行药物处理的一般程序、方法和注意事项； 4、掌握进行实验设计的一般程序和规则，学会用生物统计学方法对实验结果进行统计分析，并锻炼实践能力。 仪器和器械 离心机、生物显微镜、解剖剪刀、镊子、注射器、尖底刻度离心管、载玻片、盖玻片、塑料吸瓶、吸水纸等。 试剂及配制 （1）小牛血清（灭活） 将滤菌的小牛血清置于56℃恒温水浴保温30min灭活。灭活的小牛血清通常保存于冰箱冷冻室里。 （2）姬姆萨（Giemsa）染液（原液） 成分：Giemsa染料 3.8g、 甲醇 375mL、 甘油 125mL。 配制：将染料和少量甲醇于乳钵里仔细研磨，再加入甲醇至375mL和125mL甘油，混合均匀，放置37℃恒温箱中保温48h。保温期间，振摇数次，促使染料充分溶解，取出后过滤，两周后使用。 染毒途径和方式 染毒途径视实验目的而定，常用腹腔注射，24小时取材。 试验方法 （1）骨髓的制取 ①用断颈法处死小鼠。用剪刀剪开腿部的皮肤，用镊子夹住小鼠的股骨，剪去股骨周围的肌肉，将小鼠的两股骨取出(注意股骨的完整性)，擦净股骨上的肌肉。去股骨的髋面，将吸有0.85% Nacl生理等渗液小注射器的针头插入，反复数次吹出骨髓细(注意吹干净) 。反复吹打使其混合均匀，制成细胞悬液。 ②将细胞悬液在1000转/分离心5分钟，弃除上清液。 （2）涂片 在离心管中加入少量灭活的小牛血清（约0.3ml)混匀后，按血常规涂片法涂片，长度约2cm ~3cm (涂片时一次涂成）。在空气中晾干。 （3）固定 将干燥的涂片放入无水甲醇液（或甲醇：冰乙酸=3:1的固定液）中固定5~10 min。即使当日不染色，也应固定后于冰箱中保存。 （4）染色 将固定过的涂片放入Giemsa应用液中，染色20min~30min，然后立即用0.1mol/L磷酸盐缓冲液冲洗。 （5）封片 用滤纸及时擦干染片背面的水滴，再用双层滤纸轻轻按压染片，以吸附染片上残留的水分，再在空气中晃动数次，以促其尽快晾干，然后放入二甲苯中透明5min，取出滴上适量光学树脂胶，盖上盖玻片，写好标签。 （6）观察与计数 先用低倍镜，后用高倍镜粗略检查，选择细胞分布均匀，细胞无损，着色适当的区域，再在油浸镜下计数。虽然不计数含微核的有核细胞（主要为幼红细胞），但需用形态和染色完好的有核细胞来做判断制片优劣的标准。 选择细胞完整、分散均匀，着色适当的区域，在油镜下观察；以有核细胞形态完好作为判断制片优劣的标准，计数1000个嗜多染红细胞中有微核的细胞数。 本法系观察嗜多染红细胞的微核。用Giemsa染色法，嗜多染红细胞呈蓝灰色，成熟红细胞呈粉红或橘红色。典型的微核多为单个的、圆形、边缘光滑整齐，嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色，直径通常为红细胞的1/20～1/5。也有两个及多个微核的细胞。 微核率 每只动物计数1000个嗜多染红细胞（也可以4个同学为一个小组，每位同学计数250个细胞），最后合并计算嗜多染红细胞数中含有微核的细胞数。微核率一般以“千分率” （‰）表示。 数据处理　　利用统计学软件SPSS的单因素方差分析或 t 检验等方法，进行数据处理，分析实验结果（如下表）。 　　 实验报告 为设计性综合性报告（交打印稿），内容包括： （