生物化学与分子生物学实验指导书.docVIP

生物化学实验指导书 生命科学与工程学院 2007.09目 录 实验一 总糖的测定 2 实验二 蛋白质及氨基酸的呈色反应 5 实验三 蛋白质的等电点测定和沉淀反应 9 实验四? 氨基酸的分离鉴定―纸层析法 13 实验五 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳 15 实验六 酪蛋白的制备 18 实验七 酵母核糖核酸的分离及组分鉴定 20 实验八 肝细胞核中核酸（RNA和DNA）的分离与测定 22 实验九 紫外吸收法测定DNA含量 25 实验十 维生素C的定量测定 26 实验十一 酶的特性 29 实验十三 小麦萌发前后淀粉酶活力的比较 37 实验十四 植物体内的转氨基作用 40 实验十五 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量 44 实验十六 葡聚糖凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量 50 实验十七 质粒DNA的提取 55 实验十八 质粒DNA的酶切 57 实验十九 PCR基因扩增 59 实验二十 琼脂糖凝胶电泳检测DNA 61 实验二十一 真核生物基因组DNA制备 63 附录 65 实验一 总糖的测定 一、目的 掌握直接测定法测定总糖的原理和方法。 二、原理 样品经处理除去蛋白质等杂志后，加入盐酸，在加热条件下使蔗糖水解为还原性单糖，以直接滴定法测定水解后样品中的还原糖总量。 三、器材 1.电炉 2.滴定管 3.锥形瓶 4.容量瓶 四、试剂 1.6mol/L 盐酸溶液 2.0.1%甲基红乙醇溶液：称取0.1g 甲基红，用60%乙醇溶解并定容至100ml。 3.20%氢氧化钠溶液。 4.0.1%转化糖标准溶液：称取105℃烘干至恒重的纯蔗糖1.9000g，用水溶解并移入1000ml 容量瓶中，定容，混匀。取50ml 于100ml 容量瓶中，加6mol/L盐酸5ml，在68-70℃水浴中加热15min，取出于流动水下迅速冷却，加甲基红指示剂2 滴，用20%NaOH 溶液中和至中性，加水至刻度，混匀。此溶液每毫升含转化糖1mg。 5.费林氏A液：称取15g（CuSO4·5H2O）及0.05g次甲基蓝，溶于水并稀释到1L。 6.费林氏B 液：称取50g 酒石酸钾钠及75g 氢氧化钠，溶于水，再加入4g亚铁氰化钾，完全溶解后，用水稀释至1L，贮存于橡皮塞玻璃瓶中。 7.乙酸锌溶液：称取21.9g乙酸锌（Zn（CH3COO）2 ·2H2O），加3ml冰醋酸，加水溶解并稀释至100ml。 8.10.6%亚铁氰化钾溶液：称取10.6g亚铁氰化钾[K4Fe（CN）6 ·3H2O]，溶于水,稀释到100ml。 五、操作 1．样品处理 取适量样品，移入250ml 容量瓶中，慢慢加入5ml 乙酸锌溶液和5ml 亚铁氰化钾溶液，加水至刻度，摇匀后静置30min，用干燥滤纸过滤，弃去初滤液，收集滤液备用。 吸取处理后的样液50m 于100ml 容量瓶中，加入5ml 6mol/L 盐酸溶液，置68-70℃水浴中加热15min，取出后迅速冷却，加甲基红指示剂2 滴，用20%NaOH溶液中和至中性，加水至刻度，混匀。 2. 碱性酒石酸铜溶液的标定 准确吸取碱性酒石酸铜甲液和乙液各5ml，置于250ml 锥形瓶中，加水10ml，玻璃珠3 粒。从滴定管滴加约9ml 转化糖标准溶液，加热使其在2min 内沸腾，准确沸腾30s，趁热以每2 秒1 滴的速度继续滴加转化糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点。记录消耗转化糖标准溶液的总体积。平行操作3 次，取其平均值，按下式计算。 式中：F——10ml 碱性酒石酸铜溶液相当于转化糖的质量，mg； C——转化糖标准溶液的浓度，mg/ml； V——标定时消耗转化糖标准溶液的总体积，ml 3. 样品溶液预测 准确吸取碱性酒石酸铜甲液和乙液各5ml，置于250ml 锥形瓶中，加水10ml，玻璃珠3 粒，加热使其在2min 内沸腾，准确沸腾30s，趁热以先快后慢的速度从滴定管中滴加样品溶液，滴定时要始终保持溶液呈沸腾状态，待溶液兰色变浅时，以每2 秒1 滴的速度滴定，直至溶液蓝色刚好褪去为终点。记录样品溶液消耗的体积。 4. 样品溶液测定 准确吸取碱性酒石酸铜甲液和乙液各5ml，置于250ml 锥形瓶中，加水10ml，加玻璃珠3 粒，从滴定管滴加入比预测时样品溶液消耗总体积少1ml 的样品溶液，加热使其在2min 内沸腾，准确沸腾30s，趁热以每2 秒1 滴的速度继续滴加样液，直至蓝色刚好褪去为终点。记录消耗样品溶液的总体积。同法平行操作3份，取平均值。 5.实验计算 式中：F——10ml 碱性酒石酸铜溶液相当于转化糖的质量，mg； V1——样品处理液总体积，ml； V2——测定时消耗样品水解液体积，ml； m——样品质量，g。