GFP功能性包涵体详解.ppt

1. EmGFP 、SeGFP、cpGFP、sfGFP的光谱学性质没有较大差异； 2. ELK16可有效诱导GFP功能性包涵体的形成，且不影响重组细胞的生长； 3. 功能性包涵体产量与活性不可兼得； 4. 蛋白质的折叠稳定性与包涵体的产量呈反相关性； 5. 功能性包涵体的活性不仅受蛋白折叠稳定性的影响，蛋白质中特定氨基酸位点突变可提高功能性包涵体的生物活性。 5.致谢 请各位评委老师批评指正 并提出宝贵意见！ 谢谢！ GFP折叠突变体指示功能性包涵体产量 研究背景 研究目的及意义 结果分析 结论 致谢 1.研究背景  大肠杆菌表达系统 优点： 简单与经济 遗传背景清晰 生长周期快 表达蛋白产量高 培养简单且易于操作 缺陷： 缺乏真核细胞蛋白质翻译后修饰 缺乏一些真核细胞常用的 tRNA 表达异源蛋白常形成包涵体 包涵体 传统包涵体（Inclusion Bodies，IBs）是指不可溶、无活性的蛋白聚集体，一般呈杆状或卵圆形。 主要缺点：需经过复杂的蛋白质变复性过程以恢复其生物活性。 包涵体溶解性：不溶于水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。 功能性包涵体 近几年研究表明许多包涵体本身具有生物活性，人们把这种包涵体命名为功能性包涵体（active inclusion bodies，AIBs）。 优点： 蛋白稳定、易纯化 产量高、成本低 对宿主细胞毒性小 无需变复性过程即可发挥生物活性 影响功能性包涵体形成的因素 1、表达量过高(二硫键) 2、重组蛋白的氨基酸组成（含硫氨基酸） 3、重组蛋白所处的环境（高温、PH） 4、重组蛋白是异源蛋白(缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶) 5、宿主选择（如选择DnaK或ClpP缺失的突变株） 6、融合突变的分子伴侣（VP1,MalE31，CBDclos） 7、疏水性自聚集肽（18A，ELK16） 自组装肽ELK16 ELK16优点： 可有效诱导功能性包涵体的形成 融合蛋白表达，不会干扰细胞的正常生长 ELK16序列:LELELKLKLELELKLK 功能性包涵体的应用 作为固定化酶应用于生物催化 （ Roessl U et al，Biotechnol Lett, 2010, 32:341-350） 作为生物材料应用于医学领域 （Vázquez E et al， Adv Mater 2012, 24:1742–1747 ） 增强对蛋白折叠机制的理解 （García-Fruitós E et al， Cell Press, 2012, 30( 2) : 65- 70 ） 可以形成功能性包涵体的模式蛋白包括： β-半乳糖苷酶(β-galactosidase) D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase) 麦芽糊精磷酸化酶(maltodextrin phosphorylase) 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP) 选择GFP作为报告蛋白的原因 自发荧光、荧光性质稳定 可形成功能性包涵体 存在多种折叠性不同的GFP突变体 四种GFP折叠突变体 EmGFP:祖母绿绿色荧光蛋白突变体 sfGFP:超折叠绿色荧光蛋白突变体 SeGFP:新型超折叠绿色荧光突变体 cpGFP:循环绿色荧光蛋白突变体 2.研究目的及意义 一、分析四种GFP突变体蛋白的光谱学性质与荧光强度； 二、分析四种GFP突变体蛋白对不同变性剂的耐受性，探明不同突变体的折叠稳定性； 三、GFP折叠突变体与ELK16融合表达，诱导其形成功能性包涵体； 四、比较四种GFP突变体所形成的包涵体产量，探明蛋白折叠性与包涵体产量的相关性； 五、比较形成包涵体的全细胞的荧光强度和体外纯化包涵体的荧光强度，探明蛋白折叠性与包涵体活性的相关性。 3.结果分析 图1 EmGFP 、SeGFP、sfGFP的氨基酸序列比对 SeGFP与EmGFP相比有六个氨基酸残基突变（S30R、Y39N、N105T、Y145F、I171V和A206V） SeGFP与sfGFP相比有六个氨基酸残基不同（A72S、Q80R、K149N、V163A、T167I和L231H） 3.1 四种GFP重组基因的氨基酸序列比对 图2 cpGFP的氨基酸序列 SeGFP氨基酸序列C端的81个氨基酸装在cpGFP的N端，N端的156个氨基酸装在cpGFP的C端，中间用GGGS Linker进行连接，与ELK16之间用PT linker连接。 3.2 四种GFP重组蛋白的表达与纯化 电泳显示四种GFP均为一主条带，纯度相对较高。 图3 四种重组GFP在大