土壤中枯草芽孢杆菌的分离和筛选.docVIP

土壤中枯草芽孢杆菌的分离和筛选 座机电话号码23刘倩倩 一、实验目的 1.掌握枯草芽孢杆菌的分离筛选的基本原理，熟练掌握无菌接种技术、微生物分离筛选技术和微生物形态观察技术。 2.了解枯草芽孢杆菌的分布、营养、生长等特点，以及它所具有的产淀粉酶的功能。根据这些特点进行分离和筛选，从而得到纯菌株。 二、 实验原理 枯草芽孢杆菌属革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。有的菌株是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系。广泛分布在土壤及腐败的有机物中。选择含淀粉丰富的土壤为最佳，80度的水浴处理样品1小时，目的是杀死微生物营养体，残留芽胞。 利用稀释涂布法，在淀粉的培养基培养，培养1-3天后，观察。然后，进行初筛与纯化，利用显微镜进行革兰氏染色，确认是否为枯草芽孢杆菌。再复筛，测定其淀粉酶活，最后确定菌株。 三、实验材料 （1）选择培养基 本次实验进行产淀粉酶的枯草芽孢杆菌的筛选，所以应选淀粉培养基。 配方： 牛肉膏 5.0g 蛋白胨 10.0g 氯化钠 5.0g 可溶性淀粉 10.0g 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml 调整pH至7.2 配置时应先把淀粉用少量蒸馏水调成糊状，再加入到融化好的培养基中。 （2）溶液或试剂 牛肉膏 1.25g 蛋白胨 2.5g 氯化钠 1.25g 可溶性淀粉 2.5g 琼脂 5g 碘11克，碘原液2毫升，碘化钾42克，可溶性淀粉2克，磷酸氢二钠45.23克，柠檬酸8.068克，氯化钴25克，重铬酸钾3.34克， 100毫升0.01NHCL。 （3）仪器或其他用品 平板培养皿 10个、试管15支、三角瓶2个、烧杯3个、称量纸、高压蒸汽灭菌锅、干燥箱、恒温培养箱、超净工作台、无菌涂布器、电热恒温水浴、500ml量筒、显微镜、无菌吸管、无菌培养皿、无菌刻度吸管、酒精灯、记号笔、火柴、试管架、接种钩、滴管等。 四、实验步骤 倒平板→制备梯度稀释液→涂布→培养→初筛→复筛→纯化→保存 （1）实验前准备 制备淀粉培养基，无菌水，在121摄氏度下灭菌20min。倒平板。把接种工具，培养基，和其他用品全部在超净工作台上摆好，进行紫外线灭菌30min。 （2）制备土壤稀释液 取土样时最好选取如花坛等地方的土样，选好采样地点，产去表层5cm，去5-15cm处。用无菌器具规范采样几十克，装入无菌的塑料袋或纸袋中扎好，记录采样时间、地点、采样环境等以备考证。采样后应尽快分离。振摇约二十分钟，使土样与水充分混合，将细胞分散。放入盛有99ml无菌水三角瓶中，常压80度的水浴处理样品1小时后，取出。 用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推，制成10-2 、10-3、10-4、10-5不同稀释度的土壤溶液。 （3）涂布 将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10-3、10-4、10-5三种稀释度，然后用无菌吸管分别由10-3、10-4、10-5三管土壤稀释液中各吸取0.2ml，小心地滴在对应平板培养基表面中央位置。 用无菌涂布器涂布。右手拿无菌涂布器平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀。室温下静置5-10min，使菌液浸入培养基。 （4）