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3 RAPD / 随机扩增多态DNA 各 种 热 循 环 仪 PCR产物电泳检测示意图 反向?PCR?原理示意图 通过Southern杂交获得该已知DNA片段及其周围序列的限制性酶切位点的信息,有助于选择合适的限制性内切酶来消化模板DNA，使待扩增的DNA 片段不会太大,在4kb 左右可得到较好的综合效果. 反向?PCR?原理 16S rDNA mtDNA（CO I、CO II ） mtDNA（Cytb） PCR食品检测 PCR检测转基因食品 * 时间有限， “细胞法”直接展示次此图片即可，不解释了。 * 引物设计只讲”设计的原则是什么“即可 ，而不是原理或者机制！ 在H1N1病毒基因组上包含8个单体（非配对） RNA链代码为11蛋白(HA, NA,NP, M1, M2, NS1, NEP, PA, PB1, PB1-F2, PB2) 。总基因组大小是13588。编码血凝素的感染到宿主生物体HA; NA神经氨酸酶。 　*NP核蛋白; *M 基质蛋白 ; *NS的两种截然不同的非结构蛋白（ NS1和NEP）; *PA RNA聚合酶; * PB1 的RNA聚合酶和PB1 - F2代蛋白。  　　* PB2 RNA聚合酶。  由于片段被选择性的扩增，并不是所有序列都扩增，扩增的片段能在凝胶上清晰的显示出来。琼脂糖凝胶上DNA扩增产物的多态性反映了基因组的多态性。 1.以细胞为基础的载体法 基因克隆简单的说指的是大量产生基因片段的技术。一般有两种方法可以实现基因扩增： 2.使用PCR技术 Kary B. Mullis J3 聚合酶链反应 P161 P161 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction) 简称PCR，它是模拟DNA聚合酶在生物体内的催化作用，在体外通过使用一对与靶DNA两端互补配对的引物模拟细胞内DNA复制的机制来扩增DNA片段的技术。 1.PCR反应的过程： DNA解链（90～95℃变性） 退火（45～65 ℃ ） 链延伸（72 ℃） 90~95℃ 72℃ 保温（72 ℃） 72℃ 25~35 cycles PCR技术的特点？ 2.PCR反应体系： PCR反应五要素： 引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（Mg2+ ） 标准的PCR反应体系： 　　　10×buffer 　 3 μl 　　　 dNTP　 2 μl 　　　 引物 1 1 μl 引物 2　　　　 　 1 μl　　　　模板DNA 　　　 　 2 μl 　　 　 Taq 酶 　 1.0 U　　　　 Mg2+　　　　　 2 μl 　　　 ddH2O 　 19 μl 1. 模板 / template DNA P162 原则上凡能提供多于１个目标分子的DNA都可用作PCR模板。 常规PCR只能扩增至少已知目标分子两端序列的DNA（引物设计的基础） 无论模板DNA来源如何，只要已知一些序列信息从而能设计出引物的DNA就能应用于PCR扩增。 P162 微生物多样性分析（土壤、水体） 病原微生物检测（H1N1病毒） 食品中是否含转基因成分 DNA亲子鉴定 古生物标本（Jurassic Park） 无论模板DNA来源如何，只要已知一些序列信息从而能设计出引物的DNA就能应用于PCR扩增。 思考：PCR的模板有哪些？ 2. 引物/ Primers P162 PCR技术之所以能够在短时间内快速准确地将目的序列扩增，其关键在于反应体系中的引物； 引物设计在不违反引物设计原则的基础上时，最为简单但不失为有效的方法是以该目的基因5’端约20个碱基序列做5’端的引物，以该基因3’端20个碱基顺序的互补序列做3’端引物 ； 一对引物在模板DNA上的结合点之间的距离决定了扩增片段的长度（1kb之内是理想的扩增跨度；2kb左右是有效扩增跨度，3kb很难获得有效的扩增）。 ? 微生物多样性分析（16s rDNA） 病原微生物检测（H1N1病毒H基因） 食品中是否含转基因成分（针对其中的转基因植物成分） 动物生物多样性（mtDNA中的Cytb、COI、COII） 食品中病原体检测（沙门氏菌、LM等） 只要能引导DNA相向合成即可作为PCR扩增的引物。 思考：具体PCR的引物如何确