LCMS使用与优化预案.pptVIP

离子化方法选择 根据样品性质确定离子化方式 适合ESI的样品类型： – 高极性化合物、蛋白质、肽类、低聚核苷酸等生物分子； – 胺类、季铵盐等； – 含杂原子化合物如氨基甲酸酯等 适合APCI的样品类型： – 弱极性/中等极性的小分子，如脂肪酸，邻苯二甲酸等 – 含杂原子化合物如氨基甲酸酯、脲等 ESI不适合的化合物：极端非极性化合物如苯等； APCI不适合的化合物：非挥发性样品；热稳定性差的样品 离子化方法选择 碱性化合物宜用正离子方式 酸性化合物宜用负离子方式 如未知,可能正负都要做 有些化合物正、负模式都出峰，选择灵敏度高的方式，不明确的 优先试用正离子方式 LC条件的选择 根据化合物类型选择流动相组成，甲醇-水，乙腈-水或甲醇-乙腈-水 某些化合物只有某种流动相体系才出峰 一般正离子方式用甲醇，负离子方式用乙腈好些 通常有机相比例高些好 梯度的设定：梯度变化太快对离子化效率影响很大，相应源参数也应该改变，所以恒定比例流动相能满足分离分析要求时，尽量不用梯度，尤其定量分析时 LC条件的选择 流动相中加入甲酸、乙酸铵等可提高正离子化效率 是否加酸不是绝对的，具体应根据LC的分离情况、样品在酸性 条件下的稳定性等决定 通常pH值低时，[M+H]+比率高； pH值高时，[M+Na]+、[M+K]+，或[M+NH4]+比率高 LC条件的选择 定性分析时，有时加一些NH4+等，可帮助确定判断母离子，对碎片较少的化合物，可以增加其质谱特征性，但会使生物大分子的质谱复杂化。 水的选择：娃哈哈纯净水比普通蒸馏水好，若在玻璃瓶中已存放时间太长，有可能变质。当本底增大，LC压力增高，应更换水相。 LC条件的选择 溶解样品的溶剂：用流动相或甲醇、乙腈溶比用含水多的溶剂LC峰形好。如果常用的流动相不能很好溶解样品，可用少量特殊溶剂先将样品溶解后再用流动相稀释。 LC流量在色谱柱和MS允许情况下适当高可以压缩峰宽，使峰强度提高。 当只有大流量色谱柱，只能大流量时可采用三通分流，以适应MS的流量要求。 LC条件的选择 选细色谱柱，如内径2mm， 进样量可以小，提高相对浓度，离子化效率，灵敏度。 换长些的色谱柱，对定性分离效果好，但分析时间延长，如峰形仍不理想，可考虑另选其他型号色谱柱。 柱后补偿：当不得不用高浓度TFA时，常用异丙醇,解决信号抑制问题。通过柱后衍生化，增加离子化。 调机准备 仪器平衡时间：真空、温度、LC流动相比例时间要长些。 容器注意，塑料离心管添加剂很容易混入，尤其是被有机溶剂浸 泡时间较长时，干扰物信号有可能超过待测物。 LC PUMP脱气，先放掉柱前部管路中液体,排净气泡，还要注意储液瓶液面高度。 仪器参数的优化 实验前先进行调谐，用PPG或一已知化合物检验 先用浓度大约0.1-1ppm的标样，通过syringe pump，以5-10ul/min优化MS各项参数 优化顺序顺序：离子源各参数（喷雾针位置和电压、干燥气压力和温度、挡板电压等） 质量分析器优化顺序：Q1 SCAN－Q3 SCAN－MRM 仪器参数的优化 不同化合物参数有可能差别很大。 直接用FIA优化其它参数及源位置，或接一个三通,样品仍由注射泵进入离子源,同时LC保持需要的流量，优化干燥气压力和温度，优化后通常不用再修改 质量范围不要太宽，涵盖待测离子再增加20-30amu即可 扫描时间适当长些噪声低，当同时检测数十对离子时，MRM采样时间可以数十毫秒.同时检测数对离子时，可100-200毫秒 仪器参数的优化 母、子离子输入的质量数值要选准,要根据Q1 SCAN及Q3 SCAN得到的结果输入，不能只是整数。当不能确定精确质量数时，可选待测质量数上下各0.1amu，同时数对离子优化，最终找出灵敏度最佳的一对离子。 若样品较杂，同一化合物要选择几对母、子离子，经进样实验找出哪对有干扰，去掉，保留不易受干扰的1-2对离子。 每对离子各参数分别设，如CE，Dwell time等，对较弱离子对，扫描时间可适当长些。 手动各参数分别优化比一次MSMS breakdown效果要好，每次优化重复两次以上防偶然误差。 仪器参数的优化 根据LC流量和流动相组成确定喷雾针位置和雾化气和干燥参数，当流量大，水相多时，温度及气流要大。 调节喷雾电压，但太高有可能放电。 调节Q1及Q3分辨率。 许多参数互相影响，需要反复细调, 使信噪比得以改善。 清 洗 做完含生物体液样品后，LC需多冲些时间，使吸附到色谱柱上的干扰物完全洗脱下来。 若本底高，清洗离子源喷雾针管和毛细管 清洗管路，可从源上拆下PEEK，或将离子源从仪器上取下，用SYRINGE PUMP洗，换不同溶剂，极性、非极性、酸等轮番冲洗，最后甲醇/水。 清 洗 清